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甲醛變性電泳檢測RNA完整性
閱讀：2209 發(fā)布時(shí)間：2012-10-23甲醛變性電泳檢測RNA完整性
一、材料、試劑和儀器
1、材料：植物總RNA 5-10μg
2、試劑：
1）加樣運(yùn)載緩沖液（Loading buffer）
50% 甘油
1mmol/L EDTA （pH 8.0）
0.25%溴酚藍(lán)
25%二甲苯氰FF
2）10×TAE Buffer
3）5×甲醛凝膠電泳緩沖液：
0.1mol/L MOPs （pH7.0）
40mmol/L乙酸鈉
5mmol/L DETA（pH8.0）
4）甲醛，甲酰胺
3、儀器：電泳裝置，紫外透射觀測儀
二、實(shí)驗(yàn)程序
1、甲醛變性的瓊脂糖（Agarose） 凝膠的配制
在250mL的錐形瓶中準(zhǔn)確稱量2g Agarose （Sigama），再加20mL 10×TAE Buffer，144mLDEPC處理過的雙蒸水，微波爐中化膠，待冷卻至50-60℃加EB至終濃度≤0.5μg/mL。在通風(fēng)櫥中加入36 mL甲醛，放置一段時(shí)間以減少甲醛蒸汽。
2、RNA的甲醛變性電泳
1） 樣品制備
RNA總量10μg
5×甲醛凝膠電泳緩沖液4μl
甲醛 3.5μl
甲酰胺10μl
加入無菌離心管中混合，95℃水浴變性2min（或55℃，15min），取出后放入冰中冷卻。
2） 加入2μl無菌的DEPC處理的加樣運(yùn)載液。（使用加樣運(yùn)載液的目的有三： 增大樣品密度，以確保DNA均勻進(jìn)入樣品孔內(nèi)；使樣品呈現(xiàn)顏色，便于加樣操作；能明確顯現(xiàn)樣品在電泳膠上的泳動位置。以 0.5 X TBE作電泳液時(shí)，溴苯酚在瓊脂糖中的泳動速率與長 300 bp 的雙鏈線狀DNA相同，而二甲苯氰FF 的泳動速率與長4kb 的雙鏈線狀DNA相同。）
3）將膠板浸沒在1×甲醛凝膠電泳緩沖液中，點(diǎn)樣前5V/cm預(yù)跑5min。點(diǎn)樣后3-4V/cm電泳。
4）電泳結(jié)束后（溴苯酚藍(lán)遷移到約8cm處），紫外燈下觀察， 照相。
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