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技術(shù)文章

BIM試劑盒帶您回首七月新客戶問題匯總

閱讀:1360          發(fā)布時(shí)間:2017-8-3

新客戶一:我用TMB顯色15min后,加入2M硫酸100ul終止反應(yīng),然后讀數(shù)。發(fā)現(xiàn)加入陽性血清的OD值不穩(wěn)定,呈上漲的趨勢(shì),同時(shí)陰性和空白卻穩(wěn)定,這是什么原因呢?
上海恒遠(yuǎn):這說明沒有終止*,降低TMB的用量。一般情況下是不會(huì)漲太多的。


新客戶二:我用夾心法ELISA測(cè)細(xì)胞因子, 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)抗原敏感性只能到 ng/ml水平,我應(yīng)該從那些方面著手來提高敏感性呢?
上海恒遠(yuǎn):如果單用雙抗體夾心法測(cè)細(xì)胞因子,ELISA靈敏度能到1ng上下,這是方法學(xué)決定的。有三種方法可以提高靈敏度:一是用發(fā)光法或熒光法,有一種發(fā)光底物可直接替代TMB,效果明顯;二是用生物素親和素放大,三是用抗抗體法即包被抗體-細(xì)胞因子-單抗-抗鼠抗體接酶。zui后一種可以提高靈敏度到0.05ng。


新客戶三:我看別人洗板時(shí),用500ml瓶接輸液器直接滴滿,然后倒掉,洗板,會(huì)不會(huì)因?yàn)闈M了滴到其他孔,造成相互干擾。3%BSA不能高壓,用蒸餾水稀釋溶解后需要過濾嗎?我的預(yù)實(shí)驗(yàn)先用方正棋盤法一次摸索一抗,二抗的濃度,而HRP-Avidin先用他的說明書:1:10000 或1:5000可以嗎?再次預(yù)實(shí)驗(yàn)則固定一抗,二抗?jié)舛?,HRP-Aaidin濃度作一系列稀釋,確定HRP-Aaidin濃度,對(duì)嗎?陽性陰性值怎么確定?有的用S/P>=2.1,或大于陰性對(duì)照OD值的2.1倍,或陰性對(duì)照OD值+-2SD,到底那個(gè)對(duì)?我是雙抗體夾心測(cè)抗原,無標(biāo)準(zhǔn)品。謝謝!

上海恒遠(yuǎn):1)如果這樣洗板的話,只要*次先把孔內(nèi)液體甩去,再加洗滌液即可,不容易互相干擾的。zui后所有孔全部加滿后,放置30-60秒再甩去,這樣洗滌的更*。
2)BSA溶解后基本不用過濾,除非您的BSA質(zhì)量不好。
3)沒有標(biāo)準(zhǔn)品,那您有沒有一些基本的標(biāo)本,或者自己用純化抗原稀釋的質(zhì)控品。您必須先對(duì)您的試劑定一個(gè)要求,比如說您希望將該抗原 1ng/ml測(cè)到0.2,那您就自制一個(gè)質(zhì)控品,2ng/ml或5ng/ml都行,對(duì)應(yīng)當(dāng)OD就是0.4或1.0。陰性就用您被測(cè)的陰性血清。用質(zhì)控品和陰性血清來摸索濃度,盡量把陽性質(zhì)控品做高,陰性血清值做低。您摸濃度的過程基本可以,可以試試。
4)臨界值的制定方法有很多,一般市面上定為大于陰性對(duì)照OD值的2.1倍的其實(shí)都是定值:0.105。因?yàn)槿绻幮詫?duì)照小于0.05的話按0.05計(jì)算。也有陰性對(duì)照加定值的(可以加0.1也可以加0.2),還有用陽性對(duì)照乘以定值的。這些都可以,關(guān)鍵看您的系統(tǒng)做陰性血清可以達(dá)到多少的值,和您的zui低靈敏度的值可以到多少。

 

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