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技術(shù)文章

針對WB實驗常遇問題的5點建議(珍藏版)

閱讀:31328          發(fā)布時間:2018-1-17

   Western blot(蛋白印跡)作為科研研究中實驗其中一種方法,卻蘊含了很多知識,可謂是小實驗里卻有大文章。針對WB實驗經(jīng)常遇到的一些問題,上海恒遠生物技術(shù)專員總結(jié)出了應對的一系列“5點”建議,希望您會喜歡!


更好的了解實驗的5點注意事項:
1.陽性對照對裂解物用來表明實驗室有效并且是正確的,及可證明目標蛋白不在樣本表達。
2.跑在樣品旁邊的分子量標準能測定蛋白分子量的大小并且能監(jiān)測電泳的進展。
3.避免手指直接接觸膜,應使用鑷子,手指上的油脂與蛋白會封閉轉(zhuǎn)膜效率并易產(chǎn)生背景污斑。
4.確認裁剪的膜和濾紙與凝膠尺寸相同,邊緣太大會導致在進行轉(zhuǎn)膜時電流不能通過膜。
5.過度曝光的膠片不適合用于分析,因為不能判定相對蛋白量。


更好的解決背景高的5點建議:
1.稀釋抗體至合適濃度,以更高稀釋度抗體孵育更長時間。
2.抗體孵育溫度過高:  4℃孵育。
3.膜干燥:保證充分的反應液,避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象。
4.封閉不充分: 延長封閉時間, 考慮更換合適的封閉劑(脫脂奶粉,BSA,血清等)。
5.未結(jié)合蛋白洗滌不充分:  增加洗滌次數(shù)。


更好的解決抗體問題的5點建議:
1. 一抗,二抗的比例比較重要,調(diào)整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特異的本底。 
2. 做細胞信號傳導,要做磷酸化某因子Western Blot,對二抗無要求,要看您實驗條件來選擇,一般推薦用HRP標記的二抗。
3.不同抗體,即使是同一公司的抗體,其*的抗體稀釋度也是不一樣的,需要您實驗摸索。
4. 如果您所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸,也就是線性表位,那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western,而如果抗體識別構(gòu)象形表位,則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間。(限于單抗) 
5.抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用,但是如抗體比較珍貴,可反復使用2-3次。稀釋后應在2-3天內(nèi)使用,4度保存,避免反復凍融。


更好的解決無信號的5點建議:
1.二抗需和一抗宿主的物種相同(如一抗來自兔,二抗為抗兔抗體)。原因: 一抗和二抗不匹配。
2.參照說明書,設置陽性對照。原因:一抗不識別檢測物種蛋白。
3.每泳道蛋白上樣量不低于20~30μg,設置陽性對照。原因:抗原量不足。
4.使用可逆染色劑如麗春紅S檢測轉(zhuǎn)膜效果,檢測轉(zhuǎn)膜操作是否正確。PVDF膜預先浸在甲醇中。原因:轉(zhuǎn)膜不充分。
5. 使用含0.5%脫脂奶粉或更換封閉劑,減少封閉時間。原因:過度封閉使目標蛋白不能顯色。


更好的解決多條帶現(xiàn)象的5點建議:
1.查閱文獻。原因:體內(nèi)表達的蛋白具有多種修飾形式,如乙酰化,甲基化,糖基化等。
2.在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑。原因:蛋白樣本降解(蛋白質(zhì)分子量降低)。
3.降低抗體濃度或者抗體孵育時間。原因:一抗?jié)舛冗^高,高濃度時常出現(xiàn)多蛋白條帶。
4.使用原始未傳代的細胞株,和現(xiàn)在的細胞株一起做平行對照試驗。原因: 細胞傳代次數(shù)過多,使其蛋白表達不同。
5.降低抗體濃度,增加二抗對照(不加一抗)。原因:二抗?jié)舛冗^高,高濃度產(chǎn)生非特異結(jié)合


更好的解決其他問題的5點建議:
1.轉(zhuǎn)膜時膜上有氣泡或抗體在膜上分布不均。
2.背景有黑色斑點:抗體結(jié)合了封閉劑(過濾封閉劑)。
3.“微笑”條帶:遷移過快或電泳溫度過高,改變了pH值和遷移速度(降低遷移速度或低溫電泳)。
4.抗體量不足:確保在孵育時抗體充分浸沒膜。
5.目的條帶染色過低/過高:分離不*。

 

    上海恒遠生物為了適應市場需要和長遠發(fā)展,近年來,引進相關(guān)技術(shù)專業(yè)人才和消化*的技術(shù),不斷進行產(chǎn)品和技術(shù)的更新改進,同時完善的質(zhì)量,提高企業(yè)的整體管理水平,保證體系,專業(yè)、規(guī)范、是我們技術(shù)服務要求,科研實驗用品專業(yè)供應商之一,始終堅持;專注品質(zhì)、信守承諾、銳意進取,滿足于每一位老師的實驗要求,期待我們更美好的共贏發(fā)展!

                     

 

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