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針對WB實驗常遇問題的5點建議（珍藏版）
閱讀：31328 發(fā)布時間：2018-1-17Western blot(蛋白印跡)作為科研研究中實驗其中一種方法，卻蘊含了很多知識，可謂是小實驗里卻有大文章。針對WB實驗經(jīng)常遇到的一些問題，上海恒遠生物技術(shù)專員總結(jié)出了應對的一系列“5點”建議，希望您會喜歡！
更好的了解實驗的5點注意事項：
1.陽性對照對裂解物用來表明實驗室有效并且是正確的，及可證明目標蛋白不在樣本表達。
2.跑在樣品旁邊的分子量標準能測定蛋白分子量的大小并且能監(jiān)測電泳的進展。
3.避免手指直接接觸膜，應使用鑷子，手指上的油脂與蛋白會封閉轉(zhuǎn)膜效率并易產(chǎn)生背景污斑。
4.確認裁剪的膜和濾紙與凝膠尺寸相同，邊緣太大會導致在進行轉(zhuǎn)膜時電流不能通過膜。
5.過度曝光的膠片不適合用于分析，因為不能判定相對蛋白量。
更好的解決背景高的5點建議：
1.稀釋抗體至合適濃度，以更高稀釋度抗體孵育更長時間。
2.抗體孵育溫度過高： 4℃孵育。
3.膜干燥：保證充分的反應液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象。
4.封閉不充分： 延長封閉時間， 考慮更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等）。
5.未結(jié)合蛋白洗滌不充分： 增加洗滌次數(shù)。
更好的解決抗體問題的5點建議：
1. 一抗，二抗的比例比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。
2. 做細胞信號傳導，要做磷酸化某因子Western Blot，對二抗無要求，要看您實驗條件來選擇，一般推薦用HRP標記的二抗。
3.不同抗體，即使是同一公司的抗體，其*的抗體稀釋度也是不一樣的，需要您實驗摸索。
4. 如果您所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間。（限于單抗）
5.抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復凍融。
更好的解決無信號的5點建議：
1.二抗需和一抗宿主的物種相同（如一抗來自兔，二抗為抗兔抗體）。原因： 一抗和二抗不匹配。
2.參照說明書，設置陽性對照。原因：一抗不識別檢測物種蛋白。
3.每泳道蛋白上樣量不低于20~30μg，設置陽性對照。原因：抗原量不足。
4.使用可逆染色劑如麗春紅S檢測轉(zhuǎn)膜效果，檢測轉(zhuǎn)膜操作是否正確。PVDF膜預先浸在甲醇中。原因：轉(zhuǎn)膜不充分。
5. 使用含0.5%脫脂奶粉或更換封閉劑，減少封閉時間。原因：過度封閉使目標蛋白不能顯色。
更好的解決多條帶現(xiàn)象的5點建議：
1.查閱文獻。原因：體內(nèi)表達的蛋白具有多種修飾形式，如乙酰化，甲基化，糖基化等。
2.在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑。原因：蛋白樣本降解（蛋白質(zhì)分子量降低）。
3.降低抗體濃度或者抗體孵育時間。原因：一抗?jié)舛冗^高，高濃度時常出現(xiàn)多蛋白條帶。
4.使用原始未傳代的細胞株，和現(xiàn)在的細胞株一起做平行對照試驗。原因： 細胞傳代次數(shù)過多，使其蛋白表達不同。
5.降低抗體濃度，增加二抗對照（不加一抗）。原因：二抗?jié)舛冗^高，高濃度產(chǎn)生非特異結(jié)合
更好的解決其他問題的5點建議：
1.轉(zhuǎn)膜時膜上有氣泡或抗體在膜上分布不均。
2.背景有黑色斑點：抗體結(jié)合了封閉劑（過濾封閉劑）。
3.“微笑”條帶：遷移過快或電泳溫度過高，改變了pH值和遷移速度（降低遷移速度或低溫電泳）。
4.抗體量不足：確保在孵育時抗體充分浸沒膜。
5.目的條帶染色過低/過高：分離不*。
上海恒遠生物為了適應市場需要和長遠發(fā)展，近年來，引進相關(guān)技術(shù)專業(yè)人才和消化*的技術(shù)，不斷進行產(chǎn)品和技術(shù)的更新改進，同時完善的質(zhì)量，提高企業(yè)的整體管理水平，保證體系，專業(yè)、規(guī)范、是我們技術(shù)服務要求，科研實驗用品專業(yè)供應商之一，始終堅持；專注品質(zhì)、信守承諾、銳意進取，滿足于每一位老師的實驗要求，期待我們更美好的共贏發(fā)展！
