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技術(shù)文章

免疫印跡 的注意事項(xiàng)

閱讀:3336          發(fā)布時(shí)間:2012-9-6

1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。

1)轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜,將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上,用5ml移液管在凝膠上來回滾動(dòng)去除所有的氣泡。

2)在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙(預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕),將凝膠夾在中間,保持濕潤和沒有氣泡。

3)將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中,凝膠面向陰極。

4)將上述裝置放入緩沖液槽中,并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠。

5)按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移。

6)轉(zhuǎn)移結(jié)束后,取出薄膜和凝膠,棄去凝膠。

2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色,直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出,記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。

3. 用100ml水洗滌纖維素膜,必要時(shí)可用脫色緩沖液。

4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí)。

5. 室溫下,用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。

6. 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中,盡可能不留空氣。

7.袋的一角剪一緩沖液的小口,用透析袋夾緊。

8.混合:NGS(100微升),印跡緩沖液中的抗體(10毫升),加在裝薄膜的袋中,于室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí)(或4℃過夜)

9.用總體積300ml PBS-Tween緩沖液,分4次在一淺盤中洗滌薄膜,每次75ml。

10. 將連接生物素的羊抗兔IgG(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS)加在袋內(nèi),于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。

11.按步驟9洗滌。

12.加入抗生素蛋白-HRP(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS),于室溫下?lián)u動(dòng)。

注意事項(xiàng):

western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài),空間結(jié)構(gòu)改變,因此那些識(shí)別空間表位的抗體不能用于western blot檢測(cè)。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白物素化,再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行western blot。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。

 

 

1.蛋白質(zhì)從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(濕式轉(zhuǎn)膜)

1)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)束后,小心取出帶有凝膠的玻板,用割膠刀沿下邊緣小心撬開短板,按樣品的多少切下合適大小的凝膠。浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中5分鐘左右,以平衡離子強(qiáng)度。視情況決定是否切角標(biāo)記。

2)電泳結(jié)束前,應(yīng)泡好3M濾紙2-6張均可(普通濾紙也可)和1張硝酸纖維素濾膜。

3)戴上手套按如下順序安裝轉(zhuǎn)移裝置:

      a.平放底部電極(陰極),放一張海綿墊片。

      b.在海綿墊片上放置1-3張用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過的濾紙,逐張疊放,對(duì)齊,然后用一玻璃棒作滾筒以擠出所有氣泡,必要時(shí)可滴加轉(zhuǎn)膜液潤濕。

      c.取出浸在轉(zhuǎn)膜液中的凝膠平放于濾紙上。排除所有氣泡。

      d.把硝酸纖維素濾膜放在聚丙烯酰胺凝膠上,在硝酸纖維素濾膜與聚丙烯酰胺凝膠之間不留有氣泡。 

     e. 把zui后1-3張濾紙放在硝酸纖維素濾膜上方,同樣須確保不留氣泡。其實(shí),用玻棒給點(diǎn)壓力很容易排除氣泡。

      f.放上另一張或幾張海綿墊片,蓋上陽極板,夾緊。保證對(duì)凝膠有一定的壓力。

4)連接電源。

      我做90KD的蛋白,電轉(zhuǎn)移100分鐘,電壓100v。電轉(zhuǎn)過程中,盡量給個(gè)低溫環(huán)境,我放在冰水里轉(zhuǎn)膜,也用內(nèi)置的冰盒或者是放在4-8攝氏度的層析柜中。

5)斷開電源,拆卸轉(zhuǎn)移裝置,逐一掀去各層。將凝膠轉(zhuǎn)移至盛有考馬斯亮藍(lán)染液的托盤中,進(jìn)行染色,可檢查蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移是否*。要觀察膜上蛋白的情況可在麗春紅中染色3-10分鐘,然后蒸餾水沖洗

6)切去濾膜的左下角,以標(biāo)記,如有預(yù)染MARKER也可不標(biāo)。

7)雜交與顯色: ① 封閉 ② 一抗孵育:分別與相應(yīng)的抗體及內(nèi)參照抗體孵育 ③ 漂洗:室溫下以TBST液在平緩搖動(dòng)條件下漂洗3次以上,每次各10min。 ④ 與二抗孵育:與辣根過化物酶標(biāo)記的二抗孵育 ⑤ 漂洗:室溫下以TBST液在平緩搖動(dòng)條件下漂洗4次以上,每次各10min。 ⑥ ECL顯像;⑦ 顯影定影完畢.

 

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