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免疫印跡 的注意事項
閱讀：3337 發(fā)布時間：2012-9-61. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質電泳轉移到硝酸纖維膜上。
1）轉移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預先用轉移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。
4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉移緩沖液以淹沒凝膠。
5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉移。
6）轉移結束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標準顯現(xiàn)時取出，記錄下標準位置。
3. 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時。
5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
6. 用封口機將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。
8．混合：NGS（100微升），印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動2小時（或4℃過夜）
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。
10. 將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內，于室溫下?lián)u動1小時。
11．按步驟9洗滌。
12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下?lián)u動。
注意事項：
western blot中轉移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結構改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于western blot檢測。這種情況可以將表達目的蛋白的細胞或細胞裂解液中的所有蛋白物素化，再用酶標記親和素進行western blot。實驗中取膠和膜需帶手套。
1.蛋白質從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉移至硝酸纖維素膜（濕式轉膜）
1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結束后，小心取出帶有凝膠的玻板，用割膠刀沿下邊緣小心撬開短板，按樣品的多少切下合適大小的凝膠。浸泡在轉膜緩沖液中5分鐘左右，以平衡離子強度。視情況決定是否切角標記。
2）電泳結束前，應泡好3M濾紙2-6張均可（普通濾紙也可）和1張硝酸纖維素濾膜。
3）戴上手套按如下順序安裝轉移裝置：
a.平放底部電極（陰極），放一張海綿墊片。
b.在海綿墊片上放置1-3張用轉移緩沖液浸泡過的濾紙，逐張疊放，對齊，然后用一玻璃棒作滾筒以擠出所有氣泡，必要時可滴加轉膜液潤濕。
c.取出浸在轉膜液中的凝膠平放于濾紙上。排除所有氣泡。
d.把硝酸纖維素濾膜放在聚丙烯酰胺凝膠上，在硝酸纖維素濾膜與聚丙烯酰胺凝膠之間不留有氣泡。
e. 把zui后1-3張濾紙放在硝酸纖維素濾膜上方，同樣須確保不留氣泡。其實，用玻棒給點壓力很容易排除氣泡。
f.放上另一張或幾張海綿墊片，蓋上陽極板，夾緊。保證對凝膠有一定的壓力。
4）連接電源。
我做90KD的蛋白，電轉移100分鐘，電壓100v。電轉過程中，盡量給個低溫環(huán)境，我放在冰水里轉膜，也用內置的冰盒或者是放在4-8攝氏度的層析柜中。
5）斷開電源，拆卸轉移裝置，逐一掀去各層。將凝膠轉移至盛有考馬斯亮藍染液的托盤中，進行染色，可檢查蛋白質轉移是否*。要觀察膜上蛋白的情況可在麗春紅中染色3-10分鐘，然后蒸餾水沖洗
6）切去濾膜的左下角，以標記，如有預染MARKER也可不標。
7）雜交與顯色： ① 封閉 ② 一抗孵育：分別與相應的抗體及內參照抗體孵育 ③ 漂洗：室溫下以TBST液在平緩搖動條件下漂洗3次以上，每次各10min。 ④ 與二抗孵育：與辣根過化物酶標記的二抗孵育 ⑤ 漂洗：室溫下以TBST液在平緩搖動條件下漂洗4次以上，每次各10min。 ⑥ ECL顯像；⑦ 顯影定影完畢.