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免疫印跡 的注意事項
閱讀：3333 發(fā)布時間：2012-9-61. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。
1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。
4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠。
5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移。
6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。
3. 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時。
5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
6. 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。
8．混合：NGS（100微升），印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動2小時（或4℃過夜）
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。
10. 將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動1小時。
11．按步驟9洗滌。
12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下?lián)u動。
注意事項：
western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于western blot檢測。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白物素化，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行western blot。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。
1.蛋白質(zhì)從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（濕式轉(zhuǎn)膜）
1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)束后，小心取出帶有凝膠的玻板，用割膠刀沿下邊緣小心撬開短板，按樣品的多少切下合適大小的凝膠。浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中5分鐘左右，以平衡離子強(qiáng)度。視情況決定是否切角標(biāo)記。
2）電泳結(jié)束前，應(yīng)泡好3M濾紙2-6張均可（普通濾紙也可）和1張硝酸纖維素濾膜。
3）戴上手套按如下順序安裝轉(zhuǎn)移裝置：
a.平放底部電極（陰極），放一張海綿墊片。
b.在海綿墊片上放置1-3張用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過的濾紙，逐張疊放，對齊，然后用一玻璃棒作滾筒以擠出所有氣泡，必要時可滴加轉(zhuǎn)膜液潤濕。
c.取出浸在轉(zhuǎn)膜液中的凝膠平放于濾紙上。排除所有氣泡。
d.把硝酸纖維素濾膜放在聚丙烯酰胺凝膠上，在硝酸纖維素濾膜與聚丙烯酰胺凝膠之間不留有氣泡。
e. 把zui后1-3張濾紙放在硝酸纖維素濾膜上方，同樣須確保不留氣泡。其實(shí)，用玻棒給點(diǎn)壓力很容易排除氣泡。
f.放上另一張或幾張海綿墊片，蓋上陽極板，夾緊。保證對凝膠有一定的壓力。
4）連接電源。
我做90KD的蛋白，電轉(zhuǎn)移100分鐘，電壓100v。電轉(zhuǎn)過程中，盡量給個低溫環(huán)境，我放在冰水里轉(zhuǎn)膜，也用內(nèi)置的冰盒或者是放在4-8攝氏度的層析柜中。
5）斷開電源，拆卸轉(zhuǎn)移裝置，逐一掀去各層。將凝膠轉(zhuǎn)移至盛有考馬斯亮藍(lán)染液的托盤中，進(jìn)行染色，可檢查蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移是否*。要觀察膜上蛋白的情況可在麗春紅中染色3-10分鐘，然后蒸餾水沖洗
6）切去濾膜的左下角，以標(biāo)記，如有預(yù)染MARKER也可不標(biāo)。
7）雜交與顯色： ① 封閉 ② 一抗孵育：分別與相應(yīng)的抗體及內(nèi)參照抗體孵育 ③ 漂洗：室溫下以TBST液在平緩搖動條件下漂洗3次以上，每次各10min。 ④ 與二抗孵育：與辣根過化物酶標(biāo)記的二抗孵育 ⑤ 漂洗：室溫下以TBST液在平緩搖動條件下漂洗4次以上，每次各10min。 ⑥ ECL顯像；⑦ 顯影定影完畢.