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 ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟

 

1.試劑準(zhǔn)備：陽(yáng)性對(duì)照品，酶標(biāo)抗體，底物，

2.樣品提取：所需工具（研缽）

3.設(shè)計(jì)酶標(biāo)板布局；設(shè)兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，兩個(gè)空白對(duì)照（空白對(duì)照孔不加樣品  及酶標(biāo)試劑，其余各步驟操作相同），樣品孔。

4.加樣品到反應(yīng)孔；每個(gè)孔100ul

5孵育（室溫下2小時(shí)）一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此。無(wú)論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求控制溫育。室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。

6酶標(biāo)抗體的制備

7洗板；孵育結(jié)束后，將反應(yīng)孔中試劑倒出，加入250ul的1倍PBST緩沖液，之后快速倒出，重復(fù)2次。

8加酶標(biāo)抗體；每孔100ul

9孵育；室溫2小時(shí)

10PNP底物的制備

11洗板

12加底物

13孵育；30到60分鐘

14終止反應(yīng)；50ul 3摩爾的氫氧化鈉（選作）