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技術(shù)文章

ELISA試劑盒實驗步驟

閱讀:2491          發(fā)布時間:2013-3-14

 ELISA試劑盒實驗步驟

 


1.試劑準(zhǔn)備:陽性對照品,酶標(biāo)抗體,底物,

2.樣品提取:所需工具(研缽)

3.設(shè)計酶標(biāo)板布局;設(shè)兩個陽性對照,兩個空白對照(空白對照孔不加樣品  及酶標(biāo)試劑,其余各步驟操作相同),樣品孔。

4.加樣品到反應(yīng)孔;每個孔100ul

5孵育(室溫下2小時)一般均采用水浴,可將ELISA板置于水浴箱中,ELISA板底應(yīng)貼著水面,使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋,也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱,ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi),濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,在盒底墊濕的紗布,zui后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度,特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此。無論是水浴還是濕盒溫育,反應(yīng)板均不宜疊放,以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng),操作時的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃,但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時,ELISA板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點,一個人操作時,一次不宜多于兩塊板同時測定。

6酶標(biāo)抗體的制備

7洗板;孵育結(jié)束后,將反應(yīng)孔中試劑倒出,加入250ul的1倍PBST緩沖液,之后快速倒出,重復(fù)2次。

8加酶標(biāo)抗體;每孔100ul

9孵育;室溫2小時

10PNP底物的制備

11洗板

12加底物

13孵育;30到60分鐘

14終止反應(yīng);50ul 3摩爾的氫氧化鈉(選作)

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