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Elisa方法中結合物的制備方法

閱讀:1209          發(fā)布時間:2014-9-2

Elisa方法中結合物的制備方法
上海恒遠生物實驗中心里Elisa試劑盒結合物酶標記抗體的制備方法主要有兩種,即戊二醛交聯法和過碘酸鹽氧化法。首先跟隨恒遠一起了解下戊二醛交聯法的制備辦法。

(1)戊二醛交聯法:戊二醛是一種雙功能團,它可以使酶與蛋白質的氨基通過它而聯結。堿性磷酸一般用此法進行標記。交聯方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中,反應后即得酶標記抗體。
ELISA中常用的酶一般都用此法交聯。它具有操作簡便、有效(結合率達60%-70%)和重復性好等優(yōu)點。缺點是交聯反應是隨機的,酶與抗體交聯時分子間的比例不嚴格,結合物的大小也不均一,酶與酶,抗體與抗體之間也有可能交聯,影響效果。在兩步法中,先將酶與戊二醛作用,透析除去多余的戊二醛后,再與抗體作用而形成酶標抗體。也可先將抗體與戊二醛作用,再與酶聯結。兩步法的產物中絕大部分的酶與蛋白質是以1:1的比例結合的,較一步法的酶結合物更有助于本底的改善以提高敏感度,但其偶聯的有效率較一步法低。
恒遠生物第二種制備方法為

(2)過碘酸鹽氧化法:本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標記常用此法。反應時,過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑,可與蛋白質上的氨基形成Schiff氏堿而結合。酶標記物按克分子比例聯結,其*比例為:酶/抗體=1-2/1。此法簡便有效,一般認為是HRPzui可取的標記方法,但也有人認為所有較為強烈,各批實驗結果不易重演。 
按以上方法制備的酶結合物一般都混有未結合物的酶和抗體。理論上,結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中zui后的酶活性測定,因經過*洗滌,游離酶可被除去,并不影響zui終的顯色。但游離的抗體則不同,它會與酶標抗體競爭相應的固相抗原,從而減少了結合到固相上的酶標抗體的量。因此制備的酶結合物應予純化,去除游離的酶和抗體后用于檢測,效果更好。純化的方法很多,分離大分子化合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法zui為簡便,但效果并不理想,因為此法只能去除留在上清中的游離酶,但相當數量的游離抗體仍與酶結合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取,液相層析法可將制備的結合物清晰地分成三個部分:游離酶、游離抗體和純結合物而取得*的分離效果,但費用較貴。
結合物制得后,在用作ELISA前尚需確定其適當的工作濃度。使用過濃的結合物,既不經濟,又可使本底增高;結合物的濃度過低,則又影響檢測的敏感性。所以必須對結合物的濃度予以選擇。zui適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時,能維護一個低的本底,并獲得測定的*靈敏度,達到zui合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。就酶標抗體本身而言,它的有效工作濃度是指與其相應抗原包被的載體作試驗時,能得到陽性反應的zui高稀釋度。例如某一HRP:抗人IgG制劑標明的工作濃度為1:5000,表示該制劑經1:5000稀釋后,在與人IgG包被的固相作ELISA試驗時,將發(fā)生陽性反應。但在用于具體的ELISA檢測中,酶標抗體的zui適工作濃度受到固相載體的性質、包被抗原或抗體的純度以及整個檢測系統(tǒng)如標本、反應溫度和時間等的影響,因此必須在實際測定條件下進行\(zhòng)"滴配\"選擇能達到高敏感度的zui大稀釋度作為盒中的工作濃度。

上海恒遠生物主營范圍:ELISA試劑盒,生物試劑,血清,抗體,上海恒遠生物科技有限公司是屬于國內合資企業(yè),也是生命科學試劑的運營商,本公司專業(yè)代理國內外生命科學試劑產品,產品范圍涉及細胞生物學,分子生物學,免疫學及生物化學等實驗室科學研究試劑,包括細胞系,細胞培養(yǎng),ELISA和免疫組化抗體,一抗,二抗,單克隆和多克隆抗體,歡迎進入公司了解本司更多產品。

 

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