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          上海恒遠(yuǎn)生物解析檢測(cè)VEGF促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的方法

血管生成（Angiogenesis）是指從已有的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展而形成新的血管，主要包括：激活期血管基底膜降解；血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、遷移；重建形成新的血管和血管網(wǎng)，是一個(gè)涉及多種細(xì)胞的多種分子的復(fù)雜過(guò)程。血管形成是促血管形成因子和抑制因子協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜過(guò)程，正常情況下二者處于平衡狀態(tài)，一旦此平衡打破就會(huì)激活血管系統(tǒng)，使血管生成過(guò)度或抑制血管系統(tǒng)使血管退化。

1．用牛腎上腺內(nèi)皮細(xì)胞（AEC）檢測(cè)VEGF活性

1）取12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加0.5ml含1×10⁴牛腎上腺血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液。

2）用含0.2％明膠的PBS系列稀釋待測(cè)樣品，每孔加0.5ml稀釋樣品，以后隔天更換同樣濃度的稀釋樣品；對(duì)照孔加0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液。在37℃ 5％ CO₂的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5天。

3）用MTT法、[³H]脫氧胸苷摻入法或直接用胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)細(xì)胞的方法計(jì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)。繪制劑量-反應(yīng)曲線，取能引起50％zui大增殖反應(yīng)的zui高樣品稀釋度為1U VEGF。

上海恒遠(yuǎn)生物供應(yīng)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子試劑盒（英文：vascular endothelial growth factor，簡(jiǎn)稱(chēng)：VEGF），早期亦稱(chēng)作血管通透因子（英文：vascular permeability factor，簡(jiǎn)稱(chēng)：VPF)，是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子（heparin-binding growth factor），可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生（induce angiogenesis in vivo）。本月主推大鼠，小鼠，人等種屬試劑盒，咨詢(xún)。

2．用人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVE）檢測(cè)VEGF活性

1）分離HUVE。取明膠包被的48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加6000個(gè)細(xì)胞，含15mmol/L Hepes、20％胎牛血清和抗生素的199培養(yǎng)液，以及用同樣培養(yǎng)液系列稀釋的待測(cè)樣品，總體積0.4ml。在37℃ 5％ CO₂的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)。

2）加入0.64μCi（23.68kBq）[³H]脫氧胸苷，繼續(xù)培養(yǎng)60小時(shí)，用含1％ BSA的pH7.5 Hank液洗滌各孔。用含0.1mol/L NaOH的0.2mol/L Na₂CO₃溶液溶解細(xì)胞，釋放DNA。溶解物在液體閃爍計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)放射性摻入量，同上決定樣品中VEGF的含量。