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WB蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot, WB)樣本采集流程
一般為了提取到足夠的蛋白以及更容易地提取蛋白，需要準(zhǔn)備足夠量的樣本，要求樣本量為細(xì)胞>10°個(gè)，組織>30mg，菌體濕重>10mg,植物>100mg，血清>50uL。蛋白提取的原則:低溫快速，裂解充分。細(xì)胞樣本；一般樣本為1×10° ~1×10個(gè)細(xì)胞
蛋白質(zhì)印跡(Western Blot, WB)）又稱為免疫印跡(Immunoblot)，是利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將樣品中分子量大小不同的蛋白分開，然后通過電轉(zhuǎn)移的方法將凝膠中的蛋白定量地遷移并幾乎原位復(fù)制、固定到固相膜上，再利用抗原、抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，特殊的抗體標(biāo)記技術(shù)以及相應(yīng)的檢測方法，進(jìn)而對目的蛋白進(jìn)行定性、相對定量檢測的技術(shù)。WB實(shí)驗(yàn)流程分為樣本采集，蛋白樣品制備，上樣，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜，顯色(信號檢測)。一般為了提取到足夠的蛋白以及更容易地提取蛋白，需要準(zhǔn)備足夠量的樣本，要求樣本量為細(xì)胞>10°個(gè)，組織>30mg，菌體濕重>10mg,植物>100mg，血清>50uL。蛋白提取的原則:低溫快速，裂解充分。細(xì)胞樣本；一般樣本為1×10° ~1×10個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞量多少或不同細(xì)胞中蛋白含量的多少所加裂解液的量也不相同，一般1×10°個(gè)細(xì)胞，加裂解緩沖液100~200uL，具體實(shí)驗(yàn)操作時(shí)參照以上比例，可進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
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