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中級(jí)會(huì)員·6年您現(xiàn)在的位置： 首頁(yè)> 公司動(dòng)態(tài)> 抗原結(jié)合到抗體微珠基質(zhì)層析柱上
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將抗原結(jié)合到抗體微珠基質(zhì)上的zui簡(jiǎn)單方法是將微珠裝到一個(gè)層析柱內(nèi)，將抗原溶液流經(jīng)層析柱，當(dāng)抗原流經(jīng)層析柱時(shí)結(jié)合到抗體上而被固定，直到洗脫時(shí)才洗脫下來(lái)。這種方法的效率是根據(jù)抗原與固定的抗體之間的接觸時(shí)間決定的，所以抗原抗體之間的作用時(shí)間可以用低流速而延長(zhǎng)。
這種方法zui大一個(gè)問(wèn)題就是某些蛋白非特異性結(jié)合到分離柱上，這些蛋白可以出現(xiàn)在洗脫液中，從而使純化效率降低?；|(zhì)本身和抗體基質(zhì)復(fù)合物具有與待檢抗原溶液中蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合的表面活性。雖然這些反應(yīng)較正常的抗原—抗體反應(yīng)要弱得多，但抗原溶液中如存在大量額外的非特異性蛋白即意味著在此過(guò)程中將產(chǎn)生內(nèi)在的高本底。為了盡可能減少非特異性吸附，可以采取以下幾種措施。
首先，如采用各種親和柱純化法，所用基質(zhì)的量須調(diào)整到略高于其飽和水平。保持抗體—微珠—基質(zhì)的體積，使非特異性本底盡可能降低。捕獲大量抗原所需抗體—微珠基質(zhì)的量與流速有關(guān)。流速較慢時(shí)，柱容量更有效，因?yàn)榕悸?lián)的抗體就有更多時(shí)間與抗原結(jié)合。
第二種方案是降低柱上的非特異性吸附量。許多吸附到柱基質(zhì)上的蛋白質(zhì)是部分或全部變性的蛋白。當(dāng)制備抗原溶液時(shí)，機(jī)械性壓力應(yīng)盡可能小，并避免過(guò)度與空氣接觸。降低抗體柱上非特異結(jié)合的一種較好的方法是將抗原溶液通過(guò)一個(gè)未與抗體偶聯(lián)的瓊脂糖柱，此層析柱應(yīng)與抗體—微珠基質(zhì)柱體積相同或更大。另外一種引起非特異性結(jié)合的因素來(lái)自小顆粒碎片被阻留在柱基質(zhì)上。將抗原溶液經(jīng)過(guò)100 000g離心30min，可以去除制品中大多數(shù)較大的凝聚物。
第三種降低本底的方法是用緩沖液洗滌層析柱以去除非特異性蛋白。任何不干擾抗原抗體反應(yīng)的緩沖液都可以用于阻止非特異性結(jié)合。
