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篩選解離速率優(yōu)化的scFv

2013-1-10  閱讀(1340)

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[方法]
1.每個(gè)克隆用lml 2XTY/amp/S1u 30~C培養(yǎng)過夜,250r/min振蕩。
2.取50u1過夜培養(yǎng)物,加入到含有5ml 2XTY/amp/0.1%glu的50ml試管內(nèi);并在30℃培養(yǎng)大約2小時(shí),250r/Illin振蕩,吸光度(A600)大約0.9。
3.每管加入2.5ul lmol/LIPTG誘導(dǎo)scFv表達(dá)(終濃度為500umol/L),并在30℃培養(yǎng)4h,250r/min振蕩。在1個(gè)15ml Falcon試管內(nèi)4000g離心15分鐘,收集細(xì)胞。
4.準(zhǔn)備外周質(zhì)提取物。用200u1 PPB緩沖液重懸細(xì)菌沉淀,將沉淀懸液轉(zhuǎn)移到1.5m1試管內(nèi),放于冰上20分鐘;這會(huì)使細(xì)胞皺縮并提取部分scFv蛋白;加入低滲性MgCl2使外周質(zhì)處于高滲狀態(tài)促進(jìn)腫脹。用微型離心機(jī)沉淀細(xì)胞,6000r/min 5分鐘。棄去上清。細(xì)菌沉淀部分將用于滲透壓休克的制備。
5.準(zhǔn)備滲透壓休克組分。用200u1 5mm01/L MgSO4重懸沉淀并在冰上孵育重懸沉淀物20分鐘。用微型離心機(jī)全速(14000r/min)離Jc沉淀細(xì)胞5分鐘。取1支新試管保存上清,即為滲透壓休克組分。
6.用CentriSep柱將含有scFv的滲透壓休克緩沖液換為Blacore運(yùn)行緩沖液(HBS),操作按廠家所述進(jìn)行。
7.根據(jù)廠家說明書裝配Biacore儀。在Biacore儀流動(dòng)池內(nèi),用EDC/NHS化學(xué)法將靶抗原固化在CM5傳感芯片上,操作按廠家所述進(jìn)行。
8.將步驟5所制備的scFv樣品注入到流動(dòng)池內(nèi),1分鐘。而后,保持15u1/min的恒定流速,用HBS作為運(yùn)行緩沖液,觀察解離相2一10分鐘。
9.再生芯片的表面,并進(jìn)行下一個(gè)scFv分析??梢跃帉懗绦蚴勾诉^程自動(dòng)進(jìn)行,使40~50個(gè)scFv的數(shù)值能自動(dòng)進(jìn)行過夜分析。使用Biacore廠家提供的軟件,可對每個(gè)所分析的scFv自其感應(yīng)圖的解離部分測定出表觀κoff值。
經(jīng)過上述分析后,就能根據(jù)Aof/值高低將克隆依次排列。然后,純化解離速率zui低的scFv并測定其Kd值。這種載體附加了C末端六組氨酸標(biāo)簽,因此,用固相金屬親和層析(IMAc)從外周質(zhì)中純化出scFv。而這對于那些在已含有六組氨酸標(biāo)簽的噬菌體展示載體中的克隆來說,卻無必要。而后,用膠過濾方法去除凝集的和二聚化的scFv,用BIAcore儀進(jìn)行SPR測定κon值和Aoff值,再以此計(jì)算出Kd值。

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