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scFv和載體DNA的連接

2013-3-7  閱讀(1399)

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[器材和試劑]
●T4DNA連接酶及10×緩沖液(NEB)
●酚/氯仿(Sigma)
●100%和70%乙醇,-20℃保存
●消化的載體和scFv文庫
●TE(10mmol/L Tris pH 8,lmmol/L EDTA)

[方法]
1.如下所述,配制兩個100ul連接混合液,其中1個用于VH-VκscFv文庫,另1個用于Vu-VλscFv文庫,并設(shè)置兩個對照反應(yīng)。對照可以確定未切的載體有多少(對照2),以及確定無插入序列時有多少重新連接的載體(對照1)。要保持恰當?shù)谋壤?,所獲得的克隆數(shù)(對于相同的連接體積)應(yīng)當小于基因文庫的10%。
對照1 對照2
●10×連接緩沖液 10ul 0.5ul 0.5ul
●Millipore水 32ul 2.3ul 2.5ul
●已消化的pHENl 100ng/ul 40ul 2.Oul 2.0ul
●ScFv基因文庫(100ng/ul) 14ul
●T4 DNA連接酶(400U/ul) 4ul 0.2ul
2.孵育混合液,16℃過夜。
3.加入TE使反應(yīng)混合液體積增加至200ul。用等體積酚/氯抽提DNA。用乙醇沉淀DNA并用70%乙醇洗滌沉淀2次。

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