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生物素標記反應(yīng)原理：

 NH2-Reactive Biotin專一的與伯胺反應(yīng)（N-末端及賴氨酸殘基側(cè)鏈）形成穩(wěn)定的酰胺鍵

 

一、 實驗前準備：

仔細閱讀使用說明書。

計算待使用NH2-Reactive Biotin的量。

1.  提前20 min從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫（注：不需要用到的NH2- Reactive Biotin繼續(xù)放置冰箱中）。

2.  溶解NH2-Reactive Biotin：加入30 μL DMF至NH2-Reactive Biotin瓶中，靜置10 min，待其充分溶解，此時生物素的濃度為10 mM。

二、操作步驟：（本操作步驟按照1 mg的量進行標記）

1.  取1 mg待標記抗體于Filtration tube中，并加入相應(yīng)體積的 Labeling Buffer至總體積為0.5 mL，12,000 × g離心10 min。（注：①Filtration tube的最大體積為0.5 mL。②待標記抗體濃度低時，可先超濾離心一次。）

2.  加入13.3 μL NH2-Reactive Biotin 和適量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使抗體的終濃度為2 mg/mL，并輕輕吹打混勻。放入37℃恒溫箱中避光溫育30 min。

3.  12,000× g離心10 min。

4.  加入適量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使終體積為0.5 mL，并輕輕吹打混勻，12,000× g離心10 min。并重復(fù)操作一次。

5.  加0.2 mL Labeling Buffer至Filtration tube中，輕輕吹打。將濾芯倒轉(zhuǎn)放置于另一個離心管中，6,000× g離心10 min。

6.  收集離心管中的溶液，即為生物素標記的抗體。

三、注意事項：

1.  本試劑盒也可標記其它含有氨基（NH2-）的抗原、HRP、多肽，具體標記比例根據(jù)待標記物中氨基的數(shù)量確定。

2.  DMF要密封干燥保存，使用完立即用封口膜封緊。

3.  操作步驟5中，可用Labeling Buffer作為回收標記抗體的緩沖液，也可使用其它任何緩沖液或保護劑。

4.  本試劑盒未開封前的有效期為一年，請在有效期內(nèi)使用。

5.  本試劑盒提供的為10 kDa的Filtration tube，標記抗原或多肽請注意分子量的大小。

6.  在步驟2中，標記其它抗體時，我們應(yīng)先控制抗體的終濃度為2 mg/mL，然后再根據(jù)抗體的量計算應(yīng)加入NH2-Reactive Biotin的體積。