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技術(shù)文章

免疫學檢測法

閱讀:286          發(fā)布時間:2013-1-8

免疫學檢測法的基本原理是細胞因子(或受體)與相應的特異性抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)結(jié)合,通過同位素、熒光或酶等標記技術(shù)加以放大和顯示,從而定性或定量顯示細胞因子(或受體)的水平。這類方法的優(yōu)點是實驗周期短,少受抑制物或相似生物池功能因子的干擾,如抗體的特異性高可區(qū)分不同型或亞型的細胞因子(如IFN),一次能檢測大量標本,易標準化。與生物學活性檢測方法相比,免疫學檢測法在許多情況下敏感性低于前者,所得結(jié)果不表示生物學活性,有的McAb只能識別重組的細胞因子,在檢測天然的細胞因子中受到限制。

免疫學檢測法多采用ELISA和RIA法,可以分為平心法、競爭法和間接法。

  (一)ELISA(或RIA)平心法

  根據(jù)抗體性質(zhì)和特異性不同可有以下幾種不同的平心法ILISA。

  1.PcAb與McAb夾心法 用純化的多克隆抗體(PcAb)包被板子,加待檢細胞因子(或可溶性受體)和標準品,上層加酶標記的McAb。有時為了增加敏感性,上層加McAb后再用酶標記第二抗體顯色。

  2.McAb與PcAb夾心法 用McAb包被板子,加待檢樣品,上層加酶標記的PcAb。有時為了增加敏感性,上層加PcAb后再用釗對PcAb的酶標記抗抗體。

  3.雙McAb夾心法 選擇和應用識別同一個細胞因子(或受體)分子上不同表位的兩種McAb,其中一種包被板子,另一種McAb標記酶。由于單克隆抗體親和力識別表位地勻一,從質(zhì)量控制角度來看,一般比上兩種夾心法易控制。如目前已商品化檢測細胞因子(或其受體)的檢測盒大多采用雙單克隆抗體夾心法。

  4.細胞、McAb夾心法 用表達IL-2R的MT-1細胞包被板子,加入待檢IL-2或標準品,上層加125I標記的McAb,根據(jù)γ計數(shù)cpm值推算出待檢IL-2含量。

  (二)競爭法

 有報道用況爭法檢測IL-2水平。用免抗IL-2PcAb包袱板子,同時加入125I標記的IL-2和待測IL-2,根據(jù)γ計數(shù)cpm值得知待檢IL-2對125I-IL-2與PcAb競爭結(jié)合的程度,從而推算出待測標本IL-2的含量。這種方法檢測IL-2的敏感性可達50pg/ml。

  為了增加敏感性,在上述系統(tǒng)中可再連接上生物素,再用鏈霉親和素(streptavidin)酶標記物進行放大。此外,還可用化學發(fā)光、改進顯色底物等措施提高檢測方法的敏感性。

 

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