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撫生試劑-小鼠脾細(xì)胞和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合

閱讀:539          發(fā)布時(shí)間:2014-6-24

小鼠脾細(xì)胞和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合

1單抗技術(shù)的理論依據(jù)
單抗技術(shù)的基本原理為:小鼠骨髓瘤細(xì)胞能在體內(nèi)外無限增殖和分泌無抗體活性的免疫球蛋白,而免疫小鼠脾細(xì)胞具有產(chǎn)生抗體的能力,但不能無限增殖。采用融合劑(PEG等)將這兩種細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞。這種雜交瘤細(xì)胞具有親代細(xì)胞的主要特怔。既能在人工培養(yǎng)下無限增殖,又能產(chǎn)生特異性抗體。
淋巴雜交瘤技術(shù)是單抗技術(shù)的重要理論依據(jù)。在前文中已經(jīng)述及。Kohler和Milstein將喪失合成次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase,HGPRT)的骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。融合由仙臺(tái)病毒介導(dǎo),雜交細(xì)胞通過在含有次黃嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基喋呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)的培養(yǎng)基(HAT)中生長進(jìn)行選擇。在融合后的細(xì)胞群體里,盡管未融合的正常脾細(xì)胞和相互融合的脾細(xì)胞是HGPRT+,但不能連續(xù)培養(yǎng),只能在培養(yǎng)基中存活幾天,而未融合的HGPRT-骨髓瘤細(xì)胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤細(xì)胞不能在HAT培養(yǎng)基中存活,只有骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞因得到分別來自親本脾細(xì)胞的HGPRT和親本骨髓瘤細(xì)胞的連續(xù)繼代特性,而在HAT培養(yǎng)基中存活下來。象這種用被抗原免疫過的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合得到雜交瘤的技術(shù)就是雜交瘤技術(shù)。
上述作為融合劑的仙臺(tái)病毒在后來的實(shí)驗(yàn)過程中被聚乙二醇(PEG)代替。因?yàn)榫垡叶嫉娜诤闲Ч?,且避免了病毒的污染問題。
然而雜交瘤技術(shù)的誕生也是免疫學(xué)在理論和技術(shù)兩方面發(fā)展的必然結(jié)果,抗體生成的克隆選擇學(xué)說、抗體基因的研究、抗體結(jié)構(gòu)與生物合成以及其多樣性產(chǎn)生機(jī)制的揭示等,為雜交瘤技術(shù)提供了技術(shù)貯備。
2 單抗的制備的基本程序和方法雜交瘤技術(shù)在具體操作上,各實(shí)驗(yàn)室使用的程序不盡一致。本節(jié)中介紹的方法是適合國內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室操作的程序。
在開展雜交瘤技術(shù)制備單抗之前,培養(yǎng)骨髓瘤和雜交瘤細(xì)胞必須具備下列主要儀器設(shè)備:超凈工作臺(tái)、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱(-70℃)、倒置顯微鏡、高壓鍋、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機(jī)(水平轉(zhuǎn)子,4000r/min)、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括:100ml、50ml、25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶,10ml、1ml刻度吸管,試管,滴管(彎頭、直頭),平皿,燒杯,500ml、250ml、100ml鹽水瓶,青霉素小瓶,10ml、5ml、1ml注射器等,96孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,融合管(50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管),眼科剪刀,眼科鑷,血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,可調(diào)微量加樣器(~50ul,~200ul,~1000ul),彎頭針頭,200目篩網(wǎng),小鼠固定裝置等。淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的主要步驟包括:動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選與單抗檢測(cè)、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存、單抗的鑒定等。

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