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elisa法的實驗原理

時間:2013-5-14閱讀:2146
   [ELISA法的實驗原理]

  采用ELISA法,血清加到包被純化的肺炎衣原體抗原的微滴孔中,使之發(fā)生反應,然后去除未結合的抗體,加入結合有HRP的抗人Ig抗體使之與已結合的抗體反應,結合的HRP與發(fā)色底物發(fā)生顏色反應。zui后,終止底物反應,在酶標儀上讀出光密度值。

  [標本準備]

  取新鮮末梢血或靜脈血。如采血后24h內不能進行試驗,分離血清后將其保存于一20℃環(huán)境中。檢測時,使樣本恢復至室溫。

  [試劑]

  1.預包被微孔板

  2.陽性對照

  3.弱陽性對照

  4.陰性對照

  5.標本稀釋液

  6.濃縮酶聯(lián)物

  7.底物A、B

  8.終止液

  [儀器]

  酶標儀或全自動酶聯(lián)免疫檢測儀。

  [操作步驟]

  1.本實驗結果須結合臨床表現、病史作出診斷后,方可采取適當臨床處理。

  2.試劑盒雖然含有消除干擾因子的物質,但仍可能有少量標本難以除盡干擾。因此,如某標本多項IgM均為陽性,應考慮RF的干擾。

  3.將稀釋標本置37℃環(huán)境中20min。

  4.各加100ul陽性、弱陽性、陰性對照及已稀釋待測標本上清液于相應孔中,空白對照孔加100u1標本稀釋液,蓋好反應板,置37℃環(huán)境中30min。

  5.甩盡板中液體,每孔用200~300ul洗滌液洗5次,每次均需拍干。

  6.每孔加酶聯(lián)物100~1,蓋好反應板,置37℃環(huán)境中30min。

  7.甩盡板中液體,洗5次,每次拍干。

  8.加底物A、B各1滴或各50tzl,混勻,置37℃環(huán)境中15min。

  9.取出,加終止液1滴,用酶標儀450nm測其OD值。若肉眼觀察則不加終止液,直接判斷結果。

  [注意事項]

  1.配制洗滌液 l瓶濃縮洗滌液加475ml蒸餾水。配好的洗滌液短期內可置室溫環(huán)境中,長期可存于2—8℃環(huán)境中。

  2.配制酶聯(lián)物 按1:101倍稀釋,即取1u1濃縮酶聯(lián)物加酶聯(lián)物稀釋液1 000ul(根據檢測標本數量確定稀釋量),未用完的丟棄。

  3.待試劑盒平衡至室溫后,待測標本按1;51稀釋,即取4tA血清與200u1標本稀釋液混合。

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