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上海慧穎生物科技有限公司

elisa細胞裂解液獲取方法

時間:2013-12-11閱讀:5159

 elisa細胞裂解液獲取方法

細胞裂解是改變細胞通透性和活性的重要實驗方法。通常我們都會想到用RIPA裂解液提取的蛋白做elisa,但是這個方法不太推薦,從提取蛋白自身的角度來考慮,RIPA裂解液可以使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)破壞,即破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu),從而使抗原決定簇得以充分暴露在外,更有利于被檢測出來;而從試劑盒本身的角度來考慮,以雙抗體夾心法為例,提取的蛋白中含有RIPA裂解液,當(dāng)加入到包被的孔板當(dāng)中時,可能同樣會對孔板中的包被的抗體起到了裂解作用(如SDS),從而使其失去該有的特異性,這方面可能需要考慮在內(nèi)的。

下面我們推薦另外2種比較好的獲取細胞裂解液中蛋白的方法:

1、         凍溶法,是一種常用的機械裂解方式比,通常由冷凍和解凍兩部分組成(freezing and thawing),。原理:由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹,使細胞結(jié)構(gòu)破碎。冷凍通常在液氮或-20°C冰上進行,解凍可以在37、5065 100℃水浴中進熱休克比化學(xué)裂解溫和,但是很有效,有資料表明用熱休克和溶菌酶與SDS的方法獲得了90%的細胞裂解率。如果需求的蛋白表達很低,我們可以用細胞裂解液作輔助,方法是先用裂解液室溫裂解一小時,然后反復(fù)凍溶三次。一般可以裂解到8ug/ul。切記裂解細胞時不要加太多裂解液而且避免過多的反復(fù)凍溶。

2、         超聲波處理(Ultrasonication)既利用超聲加熱的方法,把細胞破碎。但這種處理會導(dǎo)致DNA 的斷裂,所以加熱不宜過劇烈,要設(shè)定好超聲時間和間隙時間,一般超聲時間不超過5秒,間隙時間大于超聲時間,這些都有利于保護酶的活性。bead-beating 也是常用的機械處理方式,有報道指出bead-beating 比熱休克和化學(xué)裂解的細胞裂解效果更好 雖然DNA產(chǎn)量較高,但通常得到的dna片段較小。

3、         Western Blot方法,方法步驟主要以下:

1)一瓶細胞(100ml的瓶子,PBS2次,胰酶消化,加入10ml 培養(yǎng)液,制備成細胞懸液;

2)細胞懸液移入10ml離心管中,4。C,2500rpm,離心5min;

3)上清,加入預(yù)冷的PBS(4。C存放的PBS)于離心管中,吹打,4C,2500rpm,離心5min;棄上清,重復(fù)上述步驟一次;共洗細胞2次,充分洗掉培養(yǎng)液;

4)上清,加入200ul細胞裂解液1ml裂解液中加入10ulPMSF),置于冰上,裂解40min1h;裂解過程中可用槍頭吹打或間斷搖動離心管,以使蛋白充分裂解;

5)出離心管,于4C,12000rpm,離心5min;

6)上清移入EP管中,-20。C保存,即可。

細胞裂解機制被廣泛應(yīng)用于各類的生物實驗中。為達到*的實驗結(jié)果,需要注意的是所有的實驗步驟都需在四度以下進行,并且避免過多的反復(fù)凍融。而且整個實驗過程中記得戴手套。

綜述來源:慧穎生物免疫實驗室

:王

以上所述僅供參考,希望大家指教。

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