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植物多倍體鑒定技術(shù)
點(diǎn)擊次數(shù)：1899 發(fā)布時(shí)間：2017-3-20
多倍體廣泛分布于植物界，如普通小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，棉花是四倍體，栽培草莓是八倍體等，多倍體產(chǎn)生途徑除自然發(fā)生外，化學(xué)藥劑誘導(dǎo)是很有效的途徑。不管以何種方式產(chǎn)生，檢測(cè)、鑒定多倍體就顯得很重要和迫切。
鑒定多倍體，可采用間接和直接的方法。間接方法包括形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)的觀察，直接法是直接對(duì)試材檢測(cè)染色體的數(shù)目。一般來(lái)講，多倍體植物在形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)上的特征表現(xiàn)為: 氣孔、花器、花粉粒、種子、果實(shí)甚至葉片等明顯變大，單位面積葉片上的氣孔數(shù)目減少而密度降低等?？紤]到染色體觀察、記數(shù)較為煩瑣，首先對(duì)試材從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)上來(lái)初步判斷是否為多倍體，然后把初步斷定為多倍體的試材再觀察、記錄染色體數(shù)目是否真正地發(fā)生了倍性的變異，從而zui終確定為多倍體。
芽變選種是無(wú)性繁殖植物育種的一種有效途徑，多以嵌合體的形式存在，特別是多倍體芽變。通過(guò)檢測(cè)梢端分生組織LⅠ、LⅡ 、LⅢ三層細(xì)胞的細(xì)胞、細(xì)胞核及核仁的大小，可以鑒定芽變材料倍性嵌合體的類型。
本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)多倍體鑒定的基本方法。
一、試材及用具
1．試材:玉米、小麥、棉花、草莓、番茄、蘋果等。
2．用具:顯微鏡、剪刀、培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、吸水紙、鑷子、紗布、酒精燈、物鏡測(cè)微尺、目鏡測(cè)微尺等。
3．試劑及配制
（1）卡諾氏固定液: 冰醋酸1份，加純（或95%）酒精3份，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。
（2）醋酸纖維素液: 稱取10g醋酸纖維素，加入到100 mL的丙酮溶液中，用玻棒攪拌數(shù)分鐘至醋酸纖維素全部溶解。
（3）醋酸洋紅染色劑: 取45 mL冰醋酸，加入55 mL蒸餾水，加熱至沸騰，慢慢加入2 g洋紅，煮沸約5 min，冷卻后加入2% 硫酸亞鐵。過(guò)濾，貯于棕色瓶中。
（4）解離液: 鉻酸2g，濃硫酸8 mL，濃硝酸3 mL，蒸餾水89 mL，充分混勻。
二、方法步驟
（一）間接方法
1．形態(tài)學(xué)觀察
觀察試材的形態(tài)學(xué)特征，例如葉片、果實(shí)、種子、花器等是否有較明顯的增大現(xiàn)象，如果肉眼就能觀察到明顯的增大現(xiàn)象，說(shuō)明試材很有可能是多倍體。不論形態(tài)上是否存在明顯變異，還需觀察、檢測(cè)細(xì)胞學(xué)上的變化。
2．細(xì)胞學(xué)觀察
（1）檢測(cè)氣孔大小和密度
對(duì)葉背無(wú)茸毛的材料，可直接觀察。取葉片用卡諾氏固定液固定，撕取葉片下表皮置載玻片上，滴上1～2滴醋酸洋紅染色劑染色1～2 min，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余的染液，在顯微鏡下觀察記錄氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度、寬度和氣孔的密度。
對(duì)葉背有茸毛的材料，用印膜法觀察。 選取生長(zhǎng)健壯葉片，于葉背中部（避開葉脈）涂上一層均勻醋酸纖維素液，約5 min后形成一層薄膜，用鑷子揭下薄膜，就除掉了葉背的茸毛。然后再往葉背涂一層醋酸纖維素液，注意要涂勻，在室內(nèi)涼3～5 min，用鑷子取下薄膜，置于載玻片上，加蒸餾水或醋酸洋紅染色劑1～2滴，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察氣孔的大小和密度。
對(duì)葉背茸毛多的材料，用解離液法觀察。先用醋酸纖維素液去掉茸毛，然后把葉片剪成小塊放入解離液中浸泡，直至表皮邊緣與葉肉脫離翹起，放入清水中漂洗，揭下表皮，置于載玻片上，用醋酸洋紅染色，蓋上蓋玻片，鏡檢。
把臨時(shí)制片在低倍鏡下找到氣孔，換用高倍鏡，用目鏡測(cè)微尺測(cè)量保衛(wèi)細(xì)胞大小，求30個(gè)氣孔大小的平均值。然后統(tǒng)計(jì)計(jì)算每個(gè)視野中氣孔的數(shù)目，移動(dòng)載玻片，換另外的視野，進(jìn)行10次記數(shù)，用物鏡測(cè)微尺測(cè)量視野的直徑，計(jì)算出每個(gè)視野的面積，求出單位葉面積上的氣孔的數(shù)目，即為氣孔的密度。