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人和哺乳動物原代細胞的蛋白質抽提步驟
點擊次數(shù)：1051 發(fā)布時間：2014-12-4
一、培養(yǎng)的貼壁原代細胞的蛋白質抽提基本步驟
1、從貼壁細胞培養(yǎng)瓶中小心傾去培養(yǎng)液。
2、預冷的1×PBS（pH 7.4）清洗貼壁的細胞2次，小心傾去PBS。
3、PriCells蛋白質抽提試劑（1ml抽提試劑中加入5μl蛋白酶抑制劑混合液\5μlPMSF和5μl磷酸酶混合液等等）。
4、細胞瓶中加入預冷的含抑制劑的蛋白質抽提劑（107 個細胞中加入1ml抽提試劑；5×106 個細胞中加入0.5ml抽提試劑），輕輕搖動5分鐘。
5、用一預冷的橡膠和塑料細胞刮將培養(yǎng)瓶壁上貼壁細胞刮下來，轉移細胞懸浮液到離心管中，冰浴下?lián)u動15分鐘進行裂解。
6、裂解液于預冷的離心機中14，000×g離心15分鐘。棄去沉淀，上清液蛋白質抽提物立刻轉移入新的離心管中保存待用（-80o C或液氮中）。
二、培養(yǎng)的懸浮動物細胞的蛋白質抽提步驟
1、2500×g離心10分鐘沉淀懸浮的細胞，棄去上清液
2、預冷的1×PBS（pH 7.4）懸浮沉淀細胞，2500×g離心10分鐘沉淀細胞，去上清。
3、PriCells蛋白質抽提劑（1ml抽提試劑中加入5μl蛋白酶抑制劑混合液\5μlPMSF和5μl磷酸酶混合液等等）。
4、加入預冷的含抑制劑的蛋白質抽提劑（107 個細胞中加入1ml抽提試劑；5×106 個細胞中加入0.5ml抽提試劑），輕輕搖動5分鐘。
5、細胞懸浮液到離心管中，冰浴下?lián)u動15分鐘進行裂解。
6、裂解液于預冷的離心機中14，000×g離心15分鐘。棄去沉淀，上清液蛋白質抽提物立刻轉移入新的離心管中保存待用（-80o C或液氮中）。
三、哺乳動物組織的蛋白質抽提步驟
1、組織稱重，切小塊放入管中。
3、PriCells蛋白質抽提劑（1ml抽提試劑中加入5μl蛋白酶抑制劑混合液\5μlPMSF和5μl磷酸酶混合液等等）。
3、加入預冷的含抑制劑的蛋白質抽提劑（250mg組織中加入1ml抽提試劑）。
4、用勻漿器每次30秒低速勻漿，每次勻漿間隔冰浴1分鐘，至組織*裂解。
6、裂解液于預冷的離心機中14，000×g離心15分鐘。棄去沉淀，上清液蛋白質抽提物立刻轉移入新的離心管中保存待用（-80o C或液氮中）。