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堿性磷酸酶偶氮―偶聯(lián) 法
點(diǎn)擊次數(shù)：1320 發(fā)布時(shí)間：2015-3-3
人工合成的磷酸萘酚鹽經(jīng)堿性磷酸酶 水解后釋放出萘酚，后者立即與重氮鹽偶聯(lián)生成不溶性偶氮色素。
1)孵育液配制
萘酚AS(或萘酚AS-MX) 10―25rug
N，N―二甲基甲酰胺液 0．5ml
0．2mol／LTris鹽酸緩沖液(pH 8．2―9．2) 50ml
堅(jiān)牢藍(lán)B(或BB、RR，或堅(jiān)牢紅TR、堅(jiān)牢藍(lán)VRT) 50mg
混合、攪拌及過濾，必要時(shí)可使用氫氧化鈉調(diào)整pH。
2)操作程序：
①新鮮組織冰凍切片：
②人孵育液，37C(或室溫下)孵育5―60分鐘；
③雙蒸水洗3～5分鐘；
④4％甲醛，室溫下固定10～15分鐘；
⑤蒸餾水洗3～5分鐘；
⑥甘油明膠封固。
3)結(jié)果與評(píng)價(jià)：采用不同的重氮鹽。酶的活性顯色也不同，用堅(jiān)牢藍(lán)B(或BB、RR)酶活性呈藍(lán)紫色，用堅(jiān)牢紅TR(或堅(jiān)牢紫B)酶活性呈紅色。萘酚法有三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：
①反應(yīng)產(chǎn)物溶解度小。局部比較明顯；
②萘酚化合物能較快地被水解，可縮短孵育時(shí)間；
③反應(yīng)產(chǎn)物立即可見，并顯示出顏色。
4)對(duì)照實(shí)驗(yàn)：方法與鈣―鈷法相同。