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體內(nèi)體外表達(dá)
點(diǎn)擊次數(shù)：1161 發(fā)布時(shí)間：2015-3-25
作為分子生物學(xué)領(lǐng)域老牌廠家，Promega同樣有很有特色的原核表達(dá)系統(tǒng)，不過縱觀Promega近年的表現(xiàn)，似乎不滿足于此，而是將目光投向了跨物種間的穿梭表達(dá)，以及越來越熱的體外表達(dá)系統(tǒng)了。
蛋白純化，永遠(yuǎn)是蛋白表達(dá)后zui令人關(guān)注的問題。Promega的 PinPoint? Xa 表達(dá)系統(tǒng)則是巧妙利用了生物素作為親和純化的中介――將目的基因克隆到表達(dá)載體上的一段“神秘"多肽的DNA序列后面，這段‘神秘’多肽表達(dá)后在細(xì)胞體內(nèi)會(huì)自然被生物素修飾，所以大腸桿菌表達(dá)出的融合蛋白就是已經(jīng)被生物素標(biāo)記了的融合蛋白――生物素化的融合蛋白可以在直接上親和素純化柱，進(jìn)行高度專一的親和純化，zui后用生物素就可以在非變性條件下洗脫產(chǎn)物――zui后還需要Xa因子蛋白酶切將目標(biāo)蛋白釋放出來。這個(gè)系統(tǒng)利用“神秘"多肽自動(dòng)在體內(nèi)“生物素化"，不單方便產(chǎn)物檢測(cè)、親和純化，而且得到的產(chǎn)物很多是可溶的，加上后繼的親和純化條件溫和，有助于得到活性的蛋白質(zhì)。鏈霉親和素堿性磷酸酶可直接通過“簡(jiǎn)化Western"的方法檢測(cè)帶生物素標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)。
這個(gè)系列含有三個(gè)載體，無論你想從哪里插入都有合適的表達(dá)框架。同時(shí)還含有一個(gè)專門作為對(duì)照的control載體。它含有氯素酶轉(zhuǎn)乙?；福–AT）基因，作為監(jiān)控蛋白表達(dá)、純化和加工條件的手段。載體都是利用tac啟動(dòng)子，它由lac啟動(dòng)子的-10區(qū)和trp啟動(dòng)子-35區(qū)融合而成，匯合了lac和trp兩者優(yōu)點(diǎn)，是一個(gè)很強(qiáng)的啟動(dòng)子，同樣受LacI阻遏蛋白調(diào)控。產(chǎn)量據(jù)說通?？梢赃_(dá)到1―5mg/L。用SoftLink?抗生物素蛋白親和純化樹脂是技術(shù)，可將蛋白質(zhì)以非變性形式洗脫出來?；蛘咭部梢岳肨etraLink? 四聯(lián)抗生物素蛋白樹脂對(duì)蛋白進(jìn)行純化。PinPoint 載體的特點(diǎn)是含有編碼內(nèi)源蛋白酶因子Xa(發(fā)音為ten a)的蛋白水解位點(diǎn)，使得純化標(biāo)簽可從天然蛋白上分離。載體還帶有方便得多克隆區(qū)域，便于構(gòu)建融合蛋白。整個(gè)表達(dá)系統(tǒng)不過4000人民幣，已經(jīng)包含載體菌株檢測(cè)試劑純化柱和洗脫試劑等等，一如Promega產(chǎn)品的實(shí)惠價(jià)格。
多系統(tǒng)表達(dá)，東邊不亮西邊亮
Flexi? 載體系統(tǒng)是一種用于定向克隆蛋白編碼序列的、簡(jiǎn)單而功能強(qiáng)大的方法。它是以兩種稀有的限制性內(nèi)切酶：Sgf I 和 Pme I為基礎(chǔ)。這兩種酶在我們?cè)囼?yàn)常用到的物種：人、大鼠、小鼠、線蟲等中出現(xiàn)頻率都非常小，一般情況都在5%一下。該系統(tǒng)提供快速、有效和保真度高的方法，在多種Flexi? 載體之間轉(zhuǎn)移蛋白編碼區(qū)，而無需重新測(cè)序。這一由酶和相關(guān)載體組成的系統(tǒng)，使得客戶可以很方便地將設(shè)計(jì)的開放讀碼框架（ORFs）進(jìn)行克隆，并可以根據(jù)不同的應(yīng)用目的而使其在不同種類的載體之間轉(zhuǎn)移。多系統(tǒng)表達(dá)載體除了Promega的這種之外，還有Invitrogen的Gateway技術(shù)和Qiagen的pQE-TriSytem載體。Invitrogen的Gateway技術(shù)有其桿裝病毒和酵母表達(dá)系統(tǒng)的成功顯得底氣十足，但是它有個(gè)麻煩的地方，就是要先做入門載體，之后每次再進(jìn)行位點(diǎn)專一重組轉(zhuǎn)入表達(dá)載體。Qiagen是一個(gè)載體通殺，給它加上大腸桿菌、桿裝病毒和哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子，這么看來Qiagen好像是zui方便的，但是原核和真核的RNA聚合酶識(shí)別序列畢竟是不同的，對(duì)其表達(dá)的效率存在一定質(zhì)疑。
Promega的多系統(tǒng)表達(dá)有個(gè)突出的地方是它不單有普通原核表達(dá)、融合原核表達(dá)、哺乳動(dòng)物表達(dá)，它還有體外表達(dá)。從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中提取的或通過克隆化DNA在體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA，在無細(xì)胞提取液中能被翻譯而合成蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)或進(jìn)行生物活性測(cè)定。一般用來進(jìn)行體外表達(dá)的有兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液和麥胚提取物兩種，這里有專門利用麥胚提取物的載體。
Promega不需要構(gòu)建入門載體，你在眾多載體中先選擇一個(gè)zui有希望的就可以先進(jìn)行表達(dá)了。載體的構(gòu)建過程是經(jīng)典的酶切、連接過程，利用Promega提供的酶混合溶液（SgfⅠ和PmeⅠ）在37℃溫育半個(gè)小時(shí)，65℃使失活20分鐘。將PCR產(chǎn)物純化后與酶切后的載體室溫連接1小時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)Promega的酶切和連接相對(duì)傳統(tǒng)的方法需時(shí)較短。由于載體本身在SgfⅠ與PmeⅠ酶切位點(diǎn)之間是一個(gè)致死基因，這樣使得到陽性克隆的幾率大大加大了。但是隨之而來的問題是，這種載體的儲(chǔ)存問題。普通的載體我們可以儲(chǔ)存在大腸桿菌中，不斷復(fù)制，不斷繁殖，一次購買以后可以省下很多錢。但是載體上有致死基因就只能每次都向廠家購買了。
好，現(xiàn)在你把重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)入含有DE3片段的大腸桿菌中，利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)無法表達(dá)，或者表達(dá)后想利用其它載體也進(jìn)行表達(dá)以進(jìn)行比較。那么你可以將外源片段轉(zhuǎn)移到其它載體上，F(xiàn)lexi?系統(tǒng)擁有以下幾個(gè)載體：
Flexi? 載體名稱 | 應(yīng)用 | 表達(dá)啟動(dòng)子 | 抗性 | 融合多肽 | ||
大腸桿菌 | 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 | 體外轉(zhuǎn)錄 / 翻譯 | N 末端 | |||
pF1A T7 Flexi? Vector | 表達(dá) | T7 | T7 | 氨芐青霉素 | ||
pF1K T7 Flexi? Vector | 表達(dá) | T7 | T7 | 卡那霉素 | ||
pFN2A (GST) Flexi? Vector | 表達(dá)與純化 | T7 | T7 | 氨芐青霉素 | GST | |
pFN2K (GST) Flexi? Vector | 表達(dá)與純化 | T7 | T7 | 卡那霉素 | GST | |
pF3A WG (BYDV) Flexi? Vector | 體外麥芽表達(dá) | T7, SP6 | 氨芐青霉素 | |||
pF3K WG (BYDV) Flexi? Vector | 體外麥芽表達(dá) | T7, SP6 | 卡那霉素 | |||