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蛋白定量技術(shù)
點(diǎn)擊次數(shù)：886 發(fā)布時(shí)間：2015-4-14
（一）雙縮脲測(cè)定法
1．原理 蛋白質(zhì)中的肽鍵有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中與二價(jià)銅離子形成藍(lán)紫色的絡(luò)合物，在一定的范圍內(nèi)，顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比。此法特異性強(qiáng)，游離的氨基酸、小肽和核酸均不產(chǎn)生這種反應(yīng)，但此法不夠敏感，僅能測(cè)出毫克水平。
2．試劑配制
硫酸銅（CuSO4 .5H2O） 1.50g
酒石酸鉀鈉 5.00g
H2O 500.0ml
10%氫氧化鈉（不含硫酸鈉）300ml
H2O 加至 1 000ml
此溶液可長(zhǎng)期保存，如產(chǎn)生暗紅色沉淀，則應(yīng)廢棄重配。
3．標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備
⑴ 準(zhǔn)確稱(chēng)取牛血清白蛋白1.0g（必要時(shí)須首先采用凱氏定氮法測(cè)定牛血清白蛋白制品中實(shí)際純蛋白含量，然后換算），以生理鹽水配成1%的濃度。
⑵ 將1%的牛血清白蛋白按表8-1進(jìn)行稀釋?zhuān)?/p>
表8-1 牛血清白蛋白稀釋方法表
成 分 | 試 管 號(hào) | ||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
1％蛋白 液（ml） | 1.0 | .09 | 0.8 | 0.7 | 0.6 | 0.5 | 0.4 | 0.3 | 0.2 | 0.1 | － |
蛋白 含量（mg） | 10 | 9 | 8 | 7 | 6 | 5 | 4 | 3 | 2 | 1 | － |
生理鹽水（ml） | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 | 1.1 | 1.2 | 1.3 | 1.4 | 1.5 |
雙縮脲試劑（ml） | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
試劑蛋白 含量（mg） | 8.0 | 7.2 | 6.4 | 5.6 | 4.8 | 4.0 | 3.2 | 2.4 | 1.6 | 0.8 | 0 |
注：1%牛血清白蛋白，經(jīng)凱氏定氮測(cè)定含純蛋白為80%。
⑶ 混勻后于室溫放置0.5h～1h，光電比色（540nm），順序由低濃度至高濃度，每管測(cè)3次，求其平均值。
⑷ 以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
4．樣品測(cè)定
⑴ 取樣品0.1ml，加生理鹽水1.4ml。也可將樣品做1-10稀釋加1ml，再加生理鹽水0.5ml。
⑵ 加雙縮脲試劑4.0ml，混勻，至室溫0.5h～1h。
⑶ 另以1.5ml生理鹽水加4.0ml雙縮脲試劑作為空白對(duì)照。
⑷ 測(cè)OD540 值。
⑸ 根據(jù)OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出蛋白含量。
注意：各種雙縮脲試劑的配法、加量及室溫靜置時(shí)間均有差異，一旦標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制定后，樣品的測(cè)定則必須與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制定的條件一致，否則結(jié)果有差異。
（二）紫外光譜吸收法
1．原理 本法根據(jù)蛋白之中的芳香族氨基酸－色氨酸、酪氨酸在紫外光區(qū)的吸收特點(diǎn)而建立的。蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)附近有一吸收峰，其吸收程度與這些氨基酸的含量成正比。此法靈敏度高，可測(cè)到微克水平，操作簡(jiǎn)單，不需要加各種試劑，測(cè)完后，樣品可回收。
2．標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備
⑴ 用精密天平稱(chēng)取牛血清白蛋白50mg，溶于50ml生理鹽水中。
⑵ 以生理鹽水再稀釋成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg，以鹽水對(duì)照。
⑶ 測(cè)各管OD280 值。
⑷ 以O(shè)D280 值為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。