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選擇純化凝膠的具體方法
點(diǎn)擊次數(shù)：880 發(fā)布時(shí)間：2015-5-7
生物分子下游純化的對(duì)象一般包括蛋白、酶、重組蛋白、單抗、抗體及抗原、肽類、病毒、核酸等。純化前首先需要測(cè)定生物分子的各物理和化學(xué)特性，然后通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇出zui有效的純化流程。
1.測(cè)定------分子量、PI
當(dāng)目標(biāo)蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚時(shí)，可用PAGE電泳方法或?qū)游龇椒右詼y(cè)定。分離范圍廣闊的Superose HR預(yù)裝柱很適合測(cè)定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質(zhì)在多個(gè)含不同PH緩沖液的試管中，可簡(jiǎn)易地測(cè)出PI，并選擇純化用緩沖液的*PH。
2.選擇------層析方法
若對(duì)目標(biāo)蛋白的特性或樣品成分不太了解，可嘗試幾種不同的純化方法：
一] 使用zui通用的凝膠過(guò)濾方法，選擇分離范圍廣闊的介質(zhì)如Superose、Sephacryl HR依據(jù)分子量將 樣品分成不同組份。
二] 用含專一配體或抗體的親和層析介質(zhì)結(jié)合目標(biāo)蛋白。亦可用各種活化偶聯(lián)介質(zhì)偶聯(lián)目標(biāo)蛋白的底物、受體等自制親和介質(zhì)，再用以結(jié)合目標(biāo)蛋白。一步即可得到高純度樣品。
三] 體積大的樣品，往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品，可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用于純化流程中。
3.純化------大量粗品
處理大量原液時(shí)，為避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質(zhì)。擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)利用多種STREAmlINE介質(zhì)，直接從含破碎細(xì)胞或組織萃取物的發(fā)酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結(jié)合為一。提高回收率，縮短純化周期。
4.純化------硫酸氨樣品
硫酸氨沉淀方法常被用來(lái)初步凈化樣品，經(jīng)處理過(guò)的樣本處于高鹽狀態(tài)下，很適合直接上疏水層析。若作離子交換，需先用Sephadex G-25脫鹽。疏水層析是較新技術(shù)，隨著介質(zhì)種類不斷增多，漸被融入各生產(chǎn)工藝中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八種疏水介質(zhì)中選擇介質(zhì)及*的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。
5.純水-----糖類分子
固化外源凝訂素如刀豆球蛋白、花生、大麥等凝集素，可結(jié)合碳水化合物的糖類殘基，很適合用作分離糖化細(xì)胞膜組份、細(xì)胞、甚至亞細(xì)胞細(xì)胞器，純化糖蛋白等。兩種附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質(zhì)，專為俘獲整個(gè)細(xì)胞或大復(fù)合物，如膜囊等。
6.純化------膜蛋白
膜蛋白分離常使用去污劑以保持其活性。離子性去污劑應(yīng)選用與目標(biāo)蛋白相反電荷者，避免在作離子交換時(shí)和目標(biāo)蛋白競(jìng)爭(zhēng)交換介質(zhì)，籍此除去去污劑。非離子性去污劑可以疏水層析除去。
7.純化------單抗、抗原
單抗多為IgG。來(lái)源主要是腹水和融合瘤培養(yǎng)上清液。腹水有大量白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和宿主抗體等。Mabselect、Protein G和Protein A對(duì)IgG的Fc區(qū)有專一性親和作用，能一步純化各種不同源的IgG。血清互補(bǔ)劑如小牛血清可先用蛋白G預(yù)處理，在培養(yǎng)前除去IgG。重組蛋白A介質(zhì)Mabselect和rProtein A Sepharose FF對(duì)IgG有更高的載量和專一性，基團(tuán)脫落更少。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose HP或凝膠過(guò)濾Superdex 200，很容易去除。
疏水層析Phenyl Sepharose HP亦很適合純化IgG。宿主抗體和污染IgG可用凝膠過(guò)濾Superdex 200在精細(xì)純化中去除。
純化IgG抗原zui有效的方法是用活化偶聯(lián)介質(zhì)如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶聯(lián)IgG，再進(jìn)一步獲取IgG抗原。
HiTrap IgM是用來(lái)純化融合瘤細(xì)胞培養(yǎng)的單抗IgM，結(jié)合量達(dá)5mg IgM。HiTrap IgY是專門用來(lái)純化IgY，結(jié)合量達(dá)100mg純IgY。
8.純化------重組蛋白
重組蛋白在設(shè)計(jì)、構(gòu)建時(shí)應(yīng)已融入純化構(gòu)想。樣品多夾雜了破碎細(xì)胞或溶解產(chǎn)物，擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)STREAmlINE便很適合做粗分離。Amersham biosciences提供三個(gè)快速表達(dá)、一步純化的融合系統(tǒng)。
一] GST融合載體使要表達(dá)的蛋白和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶一起表達(dá)，然后利用Glutathione Sepharose 4B作親和層析純化，再利用凝血酶或因子X(jué)a切開。
2． 蛋白A融合載體使要表達(dá)的蛋白和蛋白A的IgG結(jié)合部位融合在一起表達(dá)，以IgG Sepharose 6 FF純化。
二] 含組氨酸標(biāo)記（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金屬，在一般或變性條件（8M尿素）下透過(guò)組氨酸螯合融合蛋白。HisTrap試劑盒提供整套His-Tag蛋白的純化方法。