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測定蛋白濃度
點(diǎn)擊次數(shù)：864 發(fā)布時間：2015-5-25
一、實(shí)驗(yàn)原理
雙縮脲法（Biuret法）和Folin―酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度zui高的蛋白質(zhì)測定法。
考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的zui大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。
在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。
Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：
① 靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其zui低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。
② 測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性。因而*不用像Lowry法那樣費(fèi)時和嚴(yán)格地控制時間。
③ 干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。
此法的缺點(diǎn)是：
① 由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作 標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用 g―球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。
② 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。
③ 標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。
二、試劑與器材
1. 試劑：
① 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用 g―球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。
② 考馬斯亮蘭G―250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G―250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。
2. 器材：
① 可見光分光光度計(jì)；② 旋渦混合器；③ 試管16支。
三、操作方法
1. 標(biāo)準(zhǔn)方法
① 取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水補(bǔ)充到0.1ml。zui后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G―250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。
② 加完試劑2~5分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計(jì)上測定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對照為第1號試管，即0.1mlH2O加5.0mlG―250試劑。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。
③ 用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)，用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。
2. 微量法
當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時（10－100mg/ml），可將取樣量（包括補(bǔ)加的水）加大到0.5ml或1.0ml，空白對照則分別為0.5ml或1.0ml H2O，考馬斯亮藍(lán)G－250試劑仍加5.0ml，同時作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。