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雙向電泳溶液配制方法
點擊次數(shù)：1696 發(fā)布時間：2015-5-29
A. 裂解液 (lysis solution)
(8M Urea, 4%CHAPS, 2% Pharmalyte3-10, 40 ml)
| Final concentration | Amount | |
|---|---|---|
| Urea(Fw 60.06) | 8M | 19.2g |
| CHAPS | 4%(w/v) | 1.6g |
| Pharmalyte3-10 | 2% | 800μl |
| Double distilled H2O | To 40ml |
新鮮配制或者分裝貯存于-20℃
① 如果需要，尿素的濃度可以調(diào)高到 9或者 9.8M，也可用 7M Urea，2M Thoiurea。
② 其他的去垢劑（如 Triton X-100，NP-40，還有其它的非離子去垢劑或者雙性離子去垢劑）可以取代 CHAPS。
③ 如果需要，蛋白質(zhì)酶的抑制劑和或者還原劑可以加入。
B．水化液
（不含有 IPG buffer, Rehydration stock solution without IPG buffer）
(8M Urea, 2% CHAPS, bromophenol blue,25ml)
| Final concentration | Amount | |
|---|---|---|
| Urea (FW 60.06) | 12g | 12g |
| CHAPS | 2%(w/v) | 0.5g |
| Bromophenol blue | 0.002%(w/v) | 50μl |
| Double distilled H 2O | To 25ml |
分裝貯存于-20℃
① DTT和 IPG buffer在用之前加入：每 2.5ml 水化液加 7mg DTT。如果膠內(nèi)上樣，則樣品液在用之前加入到 2.5ml的水化液中。
② 如果需要，尿素的濃度可以調(diào)高到 9或者 9.8M。
③ 其他的去垢劑（如 Triton X-100，NP-40，還有其它的非離子去垢劑23或者雙性離子去垢劑）可以取代 CHAPS。
溴酚藍(lán)儲液
| Final concentration | Amount | |
|---|---|---|
| Bromophenol blue | 1% | 100mg |
| Tris-base | 50mM | 60mg |
| Double distilled H 2O | To 10ml |
C. 水化液
（含有 IPG buffer，Rehydration stock solution with IPG buffer）
(8M Urea，2% CHAPS，0.5% or 2% IPG buffer，bromophenol blue，25ml)
| Final concentration | Amount | |
|---|---|---|
| Urea (FW 60.06) | 8M | 12g |
| CHAPS | 2%(w/v) | 0.5g |
| IPG buffer(same pH range as the IPG strip) | 0.5%or 2%(v/v) | 125 or 500μltd> |
| Bromophenol blue | 0.002%(w/v) | 50μl 1% solution |
| Double distilled H 2O | To 25ml |
分裝貯存于-20℃
① DTT和 IPG buffer在用之前加入：每 2.5ml 水化液加 7mg DTT。如果膠內(nèi)上樣，則樣品液在用之前加入到 2.5ml的水化液中。
②IPG buffer 的濃度取決于所用的等電聚焦系統(tǒng)和 IPG膠條的 pH 范圍。
③ 如果需要，尿素的濃度可以調(diào)高到 9或者 9.8M。
④ 其他的去垢劑（如 Triton X-100，NP-40，還有其它的非離子去垢劑或者雙性離子去垢劑）可以取代 CHAPS。
⑤ 濃度為 0.5%的 IPG buffer用 125μl IPG buffer，濃度為 2%則用 500μl。
D.平衡液（SDS equlibration buffer）
(50mM Tris-cl pH8.8, 6M Urea, 30% glycerol, 2% SDS, bromophenol blue, 200ml)
| Final concentration | Amount | |
|---|---|---|
| 1.5M Tris-cl,pH8.8(see solution F) | 50mM | 50mM 6.7ml |
| Urea(Fw 60.06) | 6M | 72.07g |
| Glycerol(87% v/v) | 30%(v/v) | 69ml |
| SDS(Fw 288.38) | 2%(w/v) | 4.0g |
| Bromophenol blue | 0.002%(w/v) | 400μl 1% solution |
| Double distilled H 2O | To 200ml |
分裝 40ml 貯存于-20℃。這是一個貯存液。用之前在加 DTT或者碘乙酰胺。
E.單體貯存液（Monomer stock solution）
（30% acrylamide,0.8% N,N!-methylenebisacrylamide,200ml）
| Final concentration | Amount | |
|---|---|---|
| Acrylamide(Fw 71.08) | 30% | 60.0g |
| N,N`-methylenebisacrylamide（Fw 154.17) | 0.8% | 1.6g |
| Double distilled H 2O | To 200ml |
用 0.45微米的濾紙過濾。4℃避光保存。
F.4x分離膠溶液(4x Resolving gel buffer)
(1.5M Tris-Cl pH8.8, 1000 ml)
| Final concentration | Amount | |
|---|---|---|
| Tris-base(Fw 121.1) | 1.5M | 181.5g |
| Double distilled H 2O | 750ml | |
| HCl(Fw 36.46) | Adjust to pH8.8 | |
| Double distilled H 2O | To 1000ml |
用 0.45微米的濾紙過濾，4℃保存。
G.10% SDS溶液
| Final concentration | Amount | |
|---|---|---|
| SDS(Fw 288.38) | 10%(v/v) | 5.0g |
| Double distilled H 2O | To 50 ml |
用 0.45微米的濾紙過濾，室溫保存。
H.10%過硫酸銨(10% Ammonium persulphate)
| Final concentration | Amount | |
|---|---|---|
| Ammonium persulphate(Fw 228.20) | 10% | 0.1g |
| Double distilled H 2O | To 1ml |
當(dāng)加入水時，新鮮的過硫酸銨會發(fā)出“咔嚓"聲音。如果沒有聲音，則需要換新的藥品。用之前配制