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士鋒PCR技術(shù)：PCR產(chǎn)物測(cè)序
點(diǎn)擊次數(shù)：980 發(fā)布時(shí)間：2015-8-5
PCR技術(shù)代替了為測(cè)序而反復(fù)進(jìn)行的分子克隆和模板制備步驟。PCR技術(shù)與自動(dòng)測(cè) 序技術(shù)相結(jié)合后，它將成為一種zui快、zui有效的測(cè)定核苷權(quán)序列的方法。本章主要綜 述各種測(cè)模板的制備以及如何完成PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序。與傳統(tǒng)的將PCR片段克隆入質(zhì) 粒或病毒基因組相比，直接序列分析有兩個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn):1)由于它是一個(gè)不依賴于生 物體(如細(xì)菌、病毒等)的體外系統(tǒng)，因而它更容易標(biāo)準(zhǔn)化(即例于自化2);對(duì)于每個(gè)待 測(cè)樣品，只需測(cè)定一個(gè)單鏈序列，因而它也就更快和更準(zhǔn)確。相比之下，間接測(cè)序?yàn)?了區(qū)別在PCR反應(yīng)過程中由dna聚合酶引入的隨機(jī)錯(cuò)朽核苷酸所引起的原始基因組序列 中的突變，以及由體外重組而產(chǎn)生的人工擴(kuò)增產(chǎn)物，如產(chǎn)生鑲嵌等位基因(混合克隆) 等，每個(gè)樣品不得不測(cè)定幾個(gè)PCR產(chǎn)物克隆的序列。
不需借助在細(xì)菌中克隆就可直接獲得清蜥和準(zhǔn)確的序列結(jié)果，其難易程度取決 于:1)只擴(kuò)增靶序列的PCR引物的擴(kuò)增能力(通常稱為PCR特異性);2用以獲笪測(cè)序模板 的方法。與引物物異性及模板制備有關(guān)的問題將在下面談到。雖然DNA測(cè)序的化學(xué)法 (Maxam-Gilbrt)可以用來直接測(cè)序，但我們這里僅討論Sanger的末端終止法。
*的PCR條件
PCR反應(yīng)的特異性在很大程度上是由寡聚核苷酸引物的序列所決定的。對(duì)于特定 的引物組，PCR的特異性可以由于采用*的反應(yīng)條件、退火溫度和PCR緩沖液中的 MgCl2濃度而發(fā)生明顯的變化。如果用標(biāo)準(zhǔn)的1.5mM的MgCl2濃度不能得到所需的特異 性PCR產(chǎn)物，我們建議MgCl2的終濃度為1.4∽2.5mM之間，以0.2mM增長(zhǎng)率來改變MgCl2 濃度，以選擇*Mg++濃度。一個(gè)較常遇見的問題是，使PCR特異性達(dá)到zui高的MgCl2 濃度導(dǎo)致pcr擴(kuò)增失敗(dropouts)。這可能是由于模板DNA溶液中有較高的EDTA，它隆 低了提供給Taq DNA聚合酶MgCl2量。因此，對(duì)于擴(kuò)增溶解在TE(1mM EDTA)中的DNA， 我們建議用含2.0mM的MgCl2的PCR緩沖液。
pcr反應(yīng)的溫度范圍包含有三個(gè)不同的恒定期:變性期、退火期和延伸期，還有它 們之間的過渡期。為了獲得用于序列分析的模板或雜交探針的單鏈DNA，通常并不需 要改變參數(shù)。
凝膠純化PCR擴(kuò)增的靶序列
如果*PCR反應(yīng)條件不能產(chǎn)生所需的特異性產(chǎn)物，可采用新的寡核苷酸重新進(jìn) 行擴(kuò)增，或用凝膠電泳來分離不同的PCR產(chǎn)物，而后再各自重新擴(kuò)增進(jìn)行序列分析。 長(zhǎng)度不同的片段可以用瓊脂糖凝膠電泳來分離:
1.片段大小在80-100bp時(shí)，可采用3%NuSieve1%普通瓊脂糖或用聚丙烯酰胺膠來 分離。
2.從膠上切下含所南非PCR片段的薄片。
3.加入50∽100μlTE浸泡膠片，可反復(fù)凍融或放置幾個(gè)小時(shí)使DNA從膠中擴(kuò)散出 來。
4.取少量(1-5%)進(jìn)行第二次擴(kuò)增，為得到純凈單一的產(chǎn)物，用于第二次PCR擴(kuò)增 的凝膠抽提物的量必須少于1ng。
5.現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)瓊脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物質(zhì)。因而，如需重新擴(kuò)增供Tab聚合 酶測(cè)序用的片段，用丙烯酰胺電泳分離。
當(dāng)用PCR引物擴(kuò)增幾個(gè)同樣長(zhǎng)度的相關(guān)序列時(shí)，如來自幾個(gè)新近復(fù)制的基因，或 重復(fù)序列或保守的信號(hào)序列(conserved signal sequences)的同樣顯子，可以通過下 列兩種不同方法來改進(jìn)電泳分離。1).先用只切割某一模板的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，而后 電泳純化完整的PCR產(chǎn)物。2).用可使核苷酸序列不同的擴(kuò)增產(chǎn)物分開的電泳系統(tǒng)。下 一個(gè)部份將討論此類系統(tǒng)中的變性甲酰胺梯度凝膠系統(tǒng)。采用方法一時(shí)，必須事先了 解在不同PCR產(chǎn)物中的內(nèi)切酶位點(diǎn)。