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士鋒細菌轉化實驗
點擊次數：992 發(fā)布時間：2015-9-9
．實驗目的
細菌轉化實驗
1．以pGLO質粒轉化大腸桿菌為例，學習轉化的基本原理及方法。
2．驗證DNA是遺傳物質，加深對中心法則的理解。
二．實驗原理
轉化（transformation）是指一段同源或異源的DNA轉入受體細胞并得到表達的水平基因的轉移過程，是現代分子生物學研究和基因工程*的重要技術。目前常用的轉化方法有CaCl2法(化學轉化法)和電轉化法。本實驗是用pGLO細菌轉化試劑盒中提供的pGLO質粒來轉化大腸桿菌，所用方法為CaCl2轉化法。
pGLO質粒： 細菌轉化實驗
pGLO質粒上主要含有兩個基因，一個為編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因，一個為抗生素氨芐青霉素抗性基因。此外，該質粒還整合有一個特殊的參與受體細胞中綠色熒光蛋白表達的基因調控體系，轉化細胞中的綠色熒光蛋白基因只有在培養(yǎng)基中存在阿拉伯糖時才能啟動表達。轉化子細胞將在不含阿拉伯糖的培養(yǎng)基上呈白色而在含阿拉伯糖的培養(yǎng)基上顯綠色熒光，這種熒光在長波紫外燈下即可觀察到。
三．實驗材料
受體菌：E.coli K12 HB101
質粒：pGLO plasmid
轉化液（CaCl2）
氨芐青霉素（amp）
阿拉伯糖（ara）
培養(yǎng)基：固體LB、液體LB
細菌轉化實驗接種環(huán)、移液器等
四．實驗步驟
1. 準備平板： 每組：1塊LB平板，2塊LB/amp平板，1塊LB/amp/ara平板
2. 準備感受態(tài)細胞：用250μl無菌水或轉化液懸浮試劑盒中提供的大腸桿菌菌粉，此即感受態(tài)細胞。
3. 活化受體細胞：挑取1環(huán)E.coli K12 HB101菌液，于LB培養(yǎng)基上37℃活化16-24h。
4. 轉化：
1）在兩只無菌離心管上分別標
記+DNA, -DNA。
2）在上述兩管中分別加入
250μl轉化液。
3) 迅速置于冰上。
4）各挑取活化好的受體菌的一
個單菌落，懸浮于兩管轉化液中。
5）在標有+DNA的管中加入一
環(huán)質粒DNA，而標有-DNA的管中不加。
6）將上述兩管于冰上放置10min。
7）在準備好的培養(yǎng)基底部如左圖。