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士鋒生物PCR各處應(yīng)用模式
點(diǎn)擊次數(shù)：951 發(fā)布時(shí)間：2015-9-21
一、兼并引物（Degenerate primer）PCR
密碼子具有兼并性，如表22-4，單以氨基酸順序推測(cè)編碼的DNA序列是不的，但可以設(shè)計(jì)成對(duì)兼并引物，擴(kuò)增所有編碼已知順序的核酸序列。用兼并引物時(shí)寡核苷酸中核苷酸序列可以改變，但核苷酸的數(shù)量應(yīng)相同。兼并度越低，產(chǎn)物特異性越強(qiáng)，設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)盡量選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，針對(duì)兼并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的擴(kuò)增、克隆和序列分析?，F(xiàn)已成功地克隆了豬尿酸氧化酶基因、糖尿病相關(guān)肽基因和哺乳動(dòng)物與禽類的嗜肝病毒基因。用脫氧肌苷（deoxyinosine；DI）引物進(jìn)行PCR，可以代替編碼蛋白的多種兼并密碼子中的兼并堿基，DI的特異性主要受cDNA濃度影響。
表22-4 密碼兼并性
氨基酸
密碼子數(shù)
M、W
1
C、D、E、F、H、K、N、Q、Y
2
I
3
A、G、P、T、V
4
L、R、S
6
注：選擇使用的肽鏈避開有4～6個(gè)密碼子的氨基酸
二、套式引物（Nested Primer）PCR
用*套引物擴(kuò)增15～30個(gè)循環(huán)，再用擴(kuò)增DNA片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增15～30個(gè)循環(huán)，這樣可使待擴(kuò)增序列得到擴(kuò)增，而次級(jí)結(jié)構(gòu)卻很少擴(kuò)增。用起始引物*或Centricon30(Amicon)分子濾過(guò)器離心，在第二套引物加入前去除*引物。此方法已成功地用來(lái)分析中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞AS52的分子突變。AS52細(xì)胞含有單拷貝的細(xì)胞gpt（guanine phos－phribosy transferase）基因，與哺乳動(dòng)物具有同源性。套式引物PCR減少了引物非特異性退火，從而增加了特異性擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增效率。對(duì)環(huán)境樣品中微生物檢測(cè)和單拷貝的基因靶DNA的擴(kuò)增是非常有效的。
若將套式PCR的內(nèi)外引物稍加改變，延長(zhǎng)外引物長(zhǎng)度（至25～30bp），同進(jìn)縮短內(nèi)引物長(zhǎng)度（15～17bp），使外引物先在高溫退火溫度下做雙溫循環(huán)擴(kuò)增，然后改換至三溫循環(huán)，使內(nèi)引物在外引物擴(kuò)增的基礎(chǔ)上作低溫火溫度的三溫循環(huán)直到擴(kuò)增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時(shí)加入，兩種循環(huán)一氣呵成，等于只做一次PCR，而靈敏度與套式二次PCR無(wú)異，在我們zui近推出的PTc 51氣流式DNA熱循環(huán)儀上就可以完成全部程序。
套式一次PCR的成功，使pcr檢測(cè)的全過(guò)程可以在5h內(nèi)完成，使當(dāng)天出檢驗(yàn)報(bào)告成為現(xiàn)實(shí)，也使PCR檢測(cè)走入臨床有了現(xiàn)實(shí)的基礎(chǔ)。
三、復(fù)合PCR（Multiplex PCR）
用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增幾條DNA片段的方法稱為復(fù)合PCR。這一方法zui初是由Chanberlain 等檢測(cè)人的基因發(fā)展而來(lái)。Bej等隨之發(fā)展了對(duì)環(huán)境樣品中不同屬細(xì)菌相關(guān)基因序列同時(shí)PCR擴(kuò)增的檢測(cè)方法。兩種不同的軍團(tuán)菌（legionella）基因，一為特異嗜肺L基因（mip），另一種為L(zhǎng)-5SrRNA基因，通過(guò)引物搖擺（staggered）添加進(jìn)行復(fù)合PCR。首先mip引物PCR擴(kuò)增7個(gè)循環(huán)，然后加入5SrRNA引物PCR擴(kuò)增38個(gè)循環(huán)。加入不同量的LacZ和LacB基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增可以檢測(cè)大腸桿菌和與人類糞便污染有關(guān)的細(xì)菌包括E.coli大腸菌、腸源致病沙門氏菌和志賀氏菌。