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目的基因片段的回收
點(diǎn)擊次數(shù)：3447 發(fā)布時間：2015-11-3
6.1實(shí)驗原理
dna片段的分離與回收是基因工程操作中一項重要的技術(shù)，如可收集特定酶切片段用于基因克隆或是制備探針，回收PCR產(chǎn)物用于再次鑒定等。理想的DNA片段回收方法應(yīng)滿足以下幾個要求：
（1）回收片段應(yīng)有非常高的純度
如從普通凝膠中分離出來的片段不可帶有即使是微量的凝膠――凝膠會抑制大部分的酶活力，對于后續(xù)DNA片段用于再酶切分析或連接均是不利的。
（2）回收過程必須是嚴(yán)格的無dna酶污染的操作過程
衡量的Dnase均可能使回收的目的DNA片段降解，當(dāng)降解作用僅發(fā)生在粘性末端時，在凝膠電泳中是無法看到回收的DNA片段有任何差異，但會導(dǎo)致DNA連接實(shí)驗的失敗，zui終影響后續(xù)的克隆實(shí)驗。
（3）能回收不同大小的DNA片段
對于采用的回收方法必須能對不同大小的DNA片段均能回收，當(dāng)回收大片段時不發(fā)生機(jī)械性損傷與斷裂作用，造成大片段斷裂。
（4）回收效率要高
回收方法要能對微量DNA也能進(jìn)行操作，也即回收效率相對要較高，則對于實(shí)驗中獲得的非常微量的DNA樣品也可進(jìn)行分析。
（5）操作簡單、快速
在回收過程中一般不需特殊的實(shí)驗設(shè)備，也不需要昂貴的試劑，并且操作時間較短，象現(xiàn)在常用的試劑盒回收在電泳完成后整個回收過程只需30min左右，并且樣品的回收率可達(dá)50％。
6.1.1各類常用回收方法
由于分離方法眾多，且各種不同的方法可能同時依據(jù)多項原理，所以只能粗略地將各種方法分成五大類：電泳法、收集孔法、機(jī)械破碎法、溶（熔）膠法與酶處理法：
一、電泳法
根據(jù)凝膠割否分透析袋法與流動電洗脫法（割膠），濾紙-透析膜法與DEAE膜法（不割膠）。
（1）透析袋法
該方法可回收大于5kb的片段，缺點(diǎn)是操作麻煩并易造成DNA酶的污染。
（2）流動電洗脫法
該方法回收片段大小為4～50kb，且回收效率高達(dá)94～100％，條件下可回收大至550kb的片段。缺點(diǎn)是操作繁瑣，而且為了取得較高的回收率，需特定的流動電洗脫槽。
（3）濾紙-透析膜法
回收率平均達(dá)70％左右，不需割膠，操作相對簡單，但實(shí)驗中需將濾紙上的DNA洗脫，也較繁瑣，也不易控制。
（4）濾紙-透析膜法
此方法用于回收小片段，一般小于5kb的片段回收效率較高，可達(dá)70％以上；對于大片段（>15kb）則難以從DEAE膜上洗脫下。
二、收集孔法
（1）蔗糖法
回收小片段效率較高，564bp的PCR產(chǎn)物帶回收效率高達(dá)97.6%，并且回收中能將較寬的條帶濃縮于收集孔中，但回收中制作收集孔較麻煩，并且收集孔中要加入蔗糖，故獲得的DNA樣品不能直接用于后續(xù)實(shí)驗。
（2）羥基磷灰石法
該方法回收效率也較高，不利之處與上述方法相同，獲得的DNA需再純化，操作也較繁瑣。
三、機(jī)械破碎法
指用機(jī)械力將凝膠壓碎后再行回收DNA片段，有凍擠法，凍融法、壓碎浸泡法、（單層）濾膜過濾法及雙層（親和）膜過濾法。
（1）凍擠法
將膠條割下置于塞有玻璃棉的吸嘴或是管底刺有小孔的eppendorf管中，冰凍30min后全速離心5min，收集清液，再經(jīng)酚抽提、乙醇沉淀等純化濃縮處理（也可直接沉淀）。其基本原理理是利用離心力將凝膠中原有的液體擠出，同時也帶出膠中的DNA。從膠濃度為1%瓊脂糖中回收650bp、1.1kb、2.0kb、4.5kb的片段時，回收率分別為90％、74％、56％、30％。這是因為大分子DNA更難于被膠中的緩沖液帶出，所以此法只適用于回收較小的DNA片段。
（2）凍融法
割下的膠條放在eppendorf管中，將之搗碎并放于-80℃冰凍5min，取出后迅速放置于37℃保溫10min，如此反復(fù)3次能使DNA從膠中游離出來，離心獲得上清中即含有目的DNA，可通過沉淀濃縮獲得高濃度。對一般的DNA片段回收效率在60～80%。操作簡單，并不需特殊設(shè)備。
（3）壓碎浸泡法
又稱醋酸銨法，操作較費(fèi)時，回收效率較低，一般改良的方法是在凍擠法操作中，加入一定的水并浸泡10min，增加DNA的回收率。