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士鋒生物轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)
點(diǎn)擊次數(shù)：1119 發(fā)布時(shí)間：2015-11-10
一 、材料、試劑和儀器
1 材料 基因特異引物，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的基因組DNA，含目的基因得質(zhì)粒
2 試劑 PCR Kit
3 儀器 PCR儀（PE2400），電泳儀，紫外照相裝置
二、 操作程序
1. 在滅菌1.5mL管中25μl滅菌ddH2O,，加入100ng-1μg轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的基因組DNA中，沸水浴5-10min。取出立即置于冰上，使基因組DNA變性充分。
2．在一滅菌的0.2mL小離心管中依次加入(總體積為25 ul)：
10×buffer 2.5μl
4×dNTPs （每種2.5mM ） 2.0μl
primer I (10pmol/μl) 0.5μl
primer II(10pmol/μl) 0.5μl
Template 19μl
Taq E 0.5μl (2U)
把加樣品的EP管稍離心后，置冰上備用，待 PCR儀溫度升至94℃時(shí)，將管子插入，按Pause鍵暫停，加入Taq E 0.5μl (2U)[此為熱啟動(dòng)Hot start,可以防止非特異性擴(kuò)增 ]。其上機(jī)的循環(huán)條件為：94℃變性3min ，55℃退火30sec ,72℃延伸45sec ，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后72℃再延伸7min 以補(bǔ)平DNA末端。
3. 1%Agarose gel電泳檢測(cè)，紫外照相。
三、結(jié)果與分析
PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)在預(yù)計(jì)的分子量處出現(xiàn)單一DNA條帶，但常常是一條帶有主帶的彌散帶，這在以核基因組DNA做模板是常會(huì)出現(xiàn)，可能的原因是：核基因組復(fù)雜度高，退火溫度低，延伸時(shí)間長(zhǎng)，引物和模板量大等。解決的方法有：采用熱啟動(dòng)（如本實(shí)驗(yàn)），減少模板和引物量，提高退火溫度甚至在68℃下退火和延伸，降低退火和延伸時(shí)間，減少循環(huán)次數(shù)，改變Mg 2+濃度（1.5-8mmol/L）等。
轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)
其中M: DL2000； (+)含目的基因得質(zhì)粒為模板，作為陽(yáng)性對(duì)照；(-) 為野生型煙草基因組DNA模板作陰性對(duì)照；1-5：為轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA為模板。結(jié)果表明3非轉(zhuǎn)基因煙草，而1，2，4，5為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草。特異引物擴(kuò)增條帶長(zhǎng)為750bp。