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Southern印跡雜交
點(diǎn)擊次數(shù)：1478 發(fā)布時(shí)間：2016-1-12
實(shí)驗(yàn)原理
核酸分子雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中zui常用的具體方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補(bǔ)的原則形成雙鏈，此雜交過(guò)程是高度特異的。由于核酸分子的高度特異性及檢測(cè)方法的靈敏性，綜合凝膠電泳和核酸內(nèi)切限制酶分析的結(jié)果，便可繪制出DNA分子的限制圖譜。但為了進(jìn)一步構(gòu)建出DNA分子的遺傳圖，或進(jìn)行目的基因序列的測(cè)定以滿(mǎn)足基因克隆的特殊要求，還必須掌握DNA分子中基因編碼區(qū)的大小和位置。有關(guān)這類(lèi)數(shù)據(jù)資料可應(yīng)用Southern印跡雜交技術(shù)獲得。
Southern印跡雜交技術(shù)包括兩個(gè)主要過(guò)程：一是將待測(cè)定核酸分子通過(guò)一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）;二是固定于膜上的核酸同位素標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強(qiáng)度下退火，即分子雜交過(guò)程。該技術(shù)是1975年英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)的E.M.Southern*的，Southern印跡雜交故因此而得名。
早期的Southern印跡是將凝膠中的DNA變性后，經(jīng)毛細(xì)管的虹吸作用，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。近年來(lái)印跡方法和固定支持濾膜都有了很大的改進(jìn)，印跡方法如電轉(zhuǎn)法、真空轉(zhuǎn)移法；濾膜則發(fā)展了尼龍膜、化學(xué)活化膜（如APT、ABM纖維素膜）等。利用Southern印跡法可進(jìn)行克隆基因的酶切、圖譜分析、基因組中某一基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）等。
實(shí)驗(yàn)方法
本節(jié)以哺乳動(dòng)物基因組DNA為例，介紹的基本步驟。
一、 待測(cè)核酸樣品的制備
（一） 制備待測(cè)DNA
基因組DNA是從動(dòng)物組織（或）細(xì)胞制備。1. 采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑裂解細(xì)胞，或者用組織勻漿器研磨破碎組織中的細(xì)胞；2. 用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白質(zhì)和RNA；3. 用有機(jī)試劑（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白質(zhì)。
（二） DNA限制酶消化
基因組DNA很長(zhǎng)，需要將其切割成大小不同的片段之后才能用于雜交分析，通常用限制酶消化DNA。一般選擇一種限制酶來(lái)切割DNA分子，但有時(shí)為了某些特殊的目的，分別用不同的限制酶消化基因組DNA。切割DNA的條件可根據(jù)不同目的設(shè)定，有時(shí)可采用部分和充分消化相結(jié)合的方法獲得一些具有交叉順序的DNA片段。
消化DNA后，加入EDTA，65℃加熱滅活限制酶,樣品即可直接進(jìn)行電泳分離，必要時(shí)可進(jìn)行乙醇沉淀，濃縮DNA樣品后再進(jìn)行電泳分離。
二、 瓊脂糖凝膠電泳分離待測(cè)DNA樣品
（一） 基本原理
是先將DNA樣品(含不同大小的DNA片段)先按片斷長(zhǎng)短進(jìn)行分離，然后進(jìn)行雜交。這樣可確定雜交靶分子的大小。因此，制備DNA樣品后需要進(jìn)行電泳分離。
在恒定電壓下，將DNA樣品放在0.8～1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳可分辨70－80000bp的DNA片段，故可對(duì)DNA片段進(jìn)行分離。但需要用不同的膠濃度來(lái)分辨這個(gè)范圍內(nèi)的不同的DNA片段。原則是分辨大片斷的DNA需要用濃度較低的膠，分辨小片段DNA則需要濃度較高的膠。
瓊脂糖凝膠是由瓊脂糖形成的網(wǎng)狀物質(zhì)，具有分子篩作用。在相應(yīng)的電泳緩沖液中，DNA在電場(chǎng)的作用下由負(fù)極向正極泳動(dòng)，分子越大，泳動(dòng)速度越慢；反之，分子小則泳動(dòng)速度快，而大小相同的分子則泳動(dòng)速度相同。因此在恒定的電場(chǎng)下，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間電泳后，DNA按分子大小在凝膠中形成許多條帶，大小相同的分子處于同一條帶。另外為了便于測(cè)定待測(cè)DNA分子量的大小，往往同時(shí)在樣品鄰近的泳道中加入已知分子量的DNA樣品即標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA （DNA marker）進(jìn)行電泳。DNA marker可以用放射性核素進(jìn)行末端標(biāo)記，通過(guò)這種方式，雜交后的標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA也能顯影出條帶。
在制備凝膠和電泳過(guò)程中需要注意的幾個(gè)問(wèn)題是：*、盡可能在使用之前配制新鮮凝膠；第二、如果使用的膠比較薄，鋪膠后1h內(nèi)使用；第三、膠中不要含有EB，否則會(huì)引起非特異性背景；第四、電泳結(jié)束后用1μg/ml的EB染色，然后用水脫色（如果膠里含的是RNA，則使用無(wú)RNA酶的水），以保證核酸的完整性。
（二） 基本步驟
1. 制備瓊脂糖凝膠，盡可能薄。
DNA樣品與上樣緩沖液混勻，上樣。推薦使用的靶基因的上樣量見(jiàn)下表：
表4－1 不同條件下上樣本的使用指針比較表