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技術文章
特定基因表達水平的檢測
點擊次數：1113 發(fā)布時間：2016-1-25
繼分析DNA的southern雜交方法出現后，1977年Alwine等人提出一種與此相類似的、用于分析細胞總RNA或含polyA尾的RNA樣品中特定mRNA分子大小和豐度的分子雜交技術，這就是與Southern相對應而定名的Northern雜交技術。這一技術自出現以來，已得到廣泛應用，成為分析mRNAzui為常用的經典方法。
與Southern雜交相似，Northern雜交也采用瓊脂糖凝膠電泳，將分子量大小不同的RNA分離開來，隨后將其原位轉移至固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上，再用放射性（或非放射性）標記的DNA或RNA探針，依據其同源性進行雜交，zui后進行放射自顯影（或化學顯影），以目標RNA所在位置表示其分子量的大小，而其顯影強度則可提示目標RNA在所測樣品中的相對含量（即目標RNA的豐度）。但與Southern雜交不同的是，總RNA不需要進行酶切，即是以各個RNA分子的形式存在，可直接應用于電泳；此外，由于堿性溶液可使RNA水解，因此不進行堿變性，而是采用甲醛等進行變性電泳。雖然Northern也可檢測目標mRNA分子的大小，但更多的是用于檢測目的基因在組織細胞中有無表達及表達的水平如何。
一、試劑準備
1、0.5MEDTA:EDTA16.61g加ddH2O至80ml,調pH至8.0,定容至100ml。
2、50mMNaAc:NaAc3.4g加ddH2O至500ml,加DEPC0.5ml,振蕩,37℃，高壓滅菌。
3、5×甲醛凝膠電泳緩沖液:MOPS[3-(N-瑪琳代)丙磺酸]10.3g加50mMNaAc400ml,用2NNaOH調pH至7.0,再加入0.5MEDTA10ml,加DEPCH2O至500ml。無菌抽濾，室溫避光保存。
4、20×SSC:NaCl175.3g、檸檬酸三鈉88.2g，加ddH2O至800ml，用2NNaOH調pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC處理、高壓滅菌。
5、6×SSC:20×SSC300ml加ddH2O至1000ml。DEPC處理,高壓滅菌。
6、50×Denhardt:聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加ddH2O至50ml,無菌抽濾、分裝。
7、1MNa2HPO4:Na2HPO4•12H2O35.81g,加ddH2O至100ml。
8、1MNaH2PO4:NaH2PO4•2H2O15.6g,加ddH2O至100ml。
9、0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.6):Na2HPO435.2ml加NaH2PO464.8ml。
10、STE緩沖液:1MTris-HCl(pH8.0)2.5ml,0.5MEDTA,0.5ml,5MNaCl5ml，加ddH2O至250ml。
11、預雜交液:20×SSC5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt4ml,1M磷酸鈉緩沖液0.2ml（pH6.6）,10%SDS1ml,總體積20ml。臨用前加入變性鮭魚精DNA（10mg/ml）,使終濃度為4μl/ml。
12、DEPCH2O:1000mlddH2O中加入DEPC1ml，充分振蕩，37℃，高壓滅菌。
與Southern雜交相似，Northern雜交也采用瓊脂糖凝膠電泳，將分子量大小不同的RNA分離開來，隨后將其原位轉移至固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上，再用放射性（或非放射性）標記的DNA或RNA探針，依據其同源性進行雜交，zui后進行放射自顯影（或化學顯影），以目標RNA所在位置表示其分子量的大小，而其顯影強度則可提示目標RNA在所測樣品中的相對含量（即目標RNA的豐度）。但與Southern雜交不同的是，總RNA不需要進行酶切，即是以各個RNA分子的形式存在，可直接應用于電泳；此外，由于堿性溶液可使RNA水解，因此不進行堿變性，而是采用甲醛等進行變性電泳。雖然Northern也可檢測目標mRNA分子的大小，但更多的是用于檢測目的基因在組織細胞中有無表達及表達的水平如何。
一、試劑準備
1、0.5MEDTA:EDTA16.61g加ddH2O至80ml,調pH至8.0,定容至100ml。
2、50mMNaAc:NaAc3.4g加ddH2O至500ml,加DEPC0.5ml,振蕩,37℃，高壓滅菌。
3、5×甲醛凝膠電泳緩沖液:MOPS[3-(N-瑪琳代)丙磺酸]10.3g加50mMNaAc400ml,用2NNaOH調pH至7.0,再加入0.5MEDTA10ml,加DEPCH2O至500ml。無菌抽濾，室溫避光保存。
4、20×SSC:NaCl175.3g、檸檬酸三鈉88.2g，加ddH2O至800ml，用2NNaOH調pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC處理、高壓滅菌。
5、6×SSC:20×SSC300ml加ddH2O至1000ml。DEPC處理,高壓滅菌。
6、50×Denhardt:聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加ddH2O至50ml,無菌抽濾、分裝。
7、1MNa2HPO4:Na2HPO4•12H2O35.81g,加ddH2O至100ml。
8、1MNaH2PO4:NaH2PO4•2H2O15.6g,加ddH2O至100ml。
9、0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.6):Na2HPO435.2ml加NaH2PO464.8ml。
10、STE緩沖液:1MTris-HCl(pH8.0)2.5ml,0.5MEDTA,0.5ml,5MNaCl5ml，加ddH2O至250ml。
11、預雜交液:20×SSC5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt4ml,1M磷酸鈉緩沖液0.2ml（pH6.6）,10%SDS1ml,總體積20ml。臨用前加入變性鮭魚精DNA（10mg/ml）,使終濃度為4μl/ml。
12、DEPCH2O:1000mlddH2O中加入DEPC1ml，充分振蕩，37℃，高壓滅菌。