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RAPD技術(shù)及其在假絲酵母菌研究中的應(yīng)用
點(diǎn)擊次數(shù)：949 發(fā)布時(shí)間：2016-3-16
近年來，隨著腫瘤、自身免疫病、器官移植、糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）等患者的不斷增多，侵入性診斷治療手段的廣泛實(shí)施，各類免疫抑制劑和廣譜、超廣譜抗生素的大量使用，臨床上真菌感染呈明顯上升趨勢(shì)［1］，其中假絲酵母菌在醫(yī)院真菌感染中zui常見，占80%以上［2］，故快速、準(zhǔn)確地對(duì)其鑒定、分型并分析該菌種間、種內(nèi)的親緣關(guān)系對(duì)研究假絲酵母菌的致病性、藥物敏感性、預(yù)防監(jiān)測(cè)流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。傳統(tǒng)的真菌分型方法主要是表型分型如形態(tài)學(xué)法、血清學(xué)法、藥物敏感性分型等，但耗時(shí)費(fèi)力，易受環(huán)境及人為因素的影響，鑒別力弱，穩(wěn)定性差。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)，如：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP），單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP），隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性（RAPD），脈沖場(chǎng)凝膠電泳等，其中RAPD技術(shù)具有簡(jiǎn)便快速，短期內(nèi)可以分析大量樣本等特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)真菌研究中顯示出巨大的潛力。
1 RAPD的基本原理
隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分型法（random amplied polymorphic DNA,RAPD）又稱任意酶鏈反應(yīng)(Arbitrily primer PCR,AP-PCR)，由Williams等［3］于1990年創(chuàng)用，該方法利用任意10個(gè)左右的寡聚核苷酸鏈作引物，以所研究的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物（即DNA片段）通過瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴化乙腚（EB）染色檢測(cè)多態(tài)性，在擴(kuò)增條件相同的情況下，不同種屬的個(gè)體基因組成相差明顯，擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)不同電泳帶型，同種內(nèi)不同個(gè)體由于基因突變、插入、缺失或置換影響引物的特定結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致DNA擴(kuò)增條帶增多、減少或長(zhǎng)度改變，而同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的被認(rèn)為具有同源性，因此不僅反映生物個(gè)體之間的遺傳穩(wěn)定性，也能同時(shí)清晰敏感地反映出遺傳差異。
2 RAPD技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)
RAPD方法建立在PCR基礎(chǔ)之上，因此具有模板用量少、技術(shù)簡(jiǎn)單、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但與其他DNA多態(tài)分析方法相比較，還有其*的優(yōu)勢(shì)。
*，RAPD勿需知道模板DNA任何序列信息，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建不同種、不同菌株的基因指紋圖譜，進(jìn)而分析DNA的多態(tài)性，這是其他方法進(jìn)行此類研究所不能比擬的［4］。
第二，鑒別力強(qiáng)。Bostock［5］等將RAPD與PFGE、REA-RFLPs進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)15株白假絲酵母菌中，PFGE產(chǎn)生14個(gè)電泳核型，E.CORI-RFLPs產(chǎn)生7種不同的DNA型別,而RAPD則能分出13個(gè)亞型，是一種快速簡(jiǎn)捷的方法并有著與PFGE類似的分辨力。隨后許多學(xué)者進(jìn)行了類似的研究［6-8］，對(duì)RAPD予以高度評(píng)價(jià)，認(rèn)為目前已有的分型方法中，RAPD可能是*位選擇。
第三，RAPD技術(shù)無需DNA探針，不涉及Southern雜交，放射自顯影或其他技術(shù)，操作步驟少，實(shí)驗(yàn)周期短，成本較低，能在較短的時(shí)間內(nèi)篩選大量樣品。
3 RAPD技術(shù)在假絲酵母菌研究中的應(yīng)用
3.1 用于種間及種內(nèi)菌株分型 假絲酵母菌是條件致病菌感染中zui常見菌群，其種間及種內(nèi)分型具有重要的流行病學(xué)及臨床意義。Robert［9］等應(yīng)用1個(gè)10bp隨機(jī)引物RAPD方法將分離自非相關(guān)患者不同解剖部位的32株白假絲酵母菌分成22個(gè)不同的DNA型別。項(xiàng)明潔等［10］采用優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件對(duì)自上海瑞金醫(yī)院臨床分離的22株酵母菌菌株進(jìn)行RAPD分析，從而得到假絲酵母菌具有不同的擴(kuò)增指紋，進(jìn)而揭示了RAPD在酵母菌分型中的應(yīng)用。廉翠紅等［11］利用兩條隨機(jī)引物RAPD方法，將來源于不同陰道念珠菌病患者的97株臨床分離株分別分成19個(gè)和21個(gè)型別。可見，RAPD具有很好的分型能力。