QQ交談
您所在位置：請輸入產(chǎn)品關鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個性化：www.shifengsj.com
網(wǎng)址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://m.duoo135.com/st236594/
siRNA的設計與制備
點擊次數(shù)：1779 發(fā)布時間：2016-4-6
一．sirna的設計
在制備siRNA前都需要單獨設計siRNA序列。研究發(fā)現(xiàn)對哺乳動物細胞，zui有效的siRNAs是21-23個堿基大小，3’端有兩個突出堿基的雙鏈RNA；而對非哺乳動物細胞，比較有效的是長片段dsRNA。siRNA的序列專一性要求非常嚴謹，與靶mRNA之間一個堿基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果。
選擇siRNA靶位點：
從轉(zhuǎn)錄本AUG起始密碼子開始，搜尋下游AA序列，記錄跟每個AA 3’端相鄰的19個核苷酸作為侯選的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5’端和3’端的非編碼區(qū)（untranslated regons, UTRs），原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結合區(qū)域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。
序列同源分析：
將潛在的序列和相應的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選出合適的目標序列進行合成。并非所有符合條件的siRNA都一樣有效，其原因還不清楚，可能始位置效應的結果，因此對于一個目的基因，一般要選擇3-5個靶位點來設計siRNA。通常來說，每個目標序列設計3-4對siRNAs，選擇zui有效的進行后續(xù)研究。
設計陰性對照：
一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA中的堿基序列打亂。當然，同樣要保證它和其他基因沒有同源性。
此外網(wǎng)上提供提供免費的siRNA設計工具www.qiagen。。ｃｏｍ/siRNA,
http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/
二．siRNA的獲得
1．化學合成
盡管化學合成siRNA是zui貴的方法，但卻是zui方便的---研究人員幾乎不需要做什么工作就可以拿到高質(zhì)量的siRNA。如QIAGEN-Xeragon公司可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學合成siRNA（可帶標記）。它zui適用的情況是：已經(jīng)找到zui有效的siRNA序列，需要大量siRNA進行研究。QIAGEN還提供siRNA設計合成一體化服務“4-for Silencing siRNA duplexes” : 針對客戶給出的一個基因序列，由QIAGEN的專家設計并合成4對siRNA，HPP純度，保證至少一對抑制效率達到70%以上，如果達不到，免費為客戶另行設計合成另外4對siRNA。
siRNA的設計與制備
Figure 1. HeLa-S3 cells were plated out in 24-well plates at a density of 6×104 cells in each well, 24 hours after transfection. Cells were transfected with lamin A/C siRNA using the transfection reagents indicated, according to the manufacturer’s protocol. mRNA was purified from the cells 48 hours after transfection and quantitative RT-PCR was performed using the QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit eith primers targeted to lamin.