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PCR常用優(yōu)化策略
點(diǎn)擊次數(shù)：1091 發(fā)布時間：2016-4-19
PCR過程中如果沒有找到*的擴(kuò)增條件將會導(dǎo)致產(chǎn)生許多不確定的、不需要的產(chǎn)物，有時甚至沒有目的產(chǎn)物；而在另一個，又可能沒有擴(kuò)增到任何產(chǎn)物。這時改變已知對引物－模板的忠實(shí)性和引物延伸有影響的諸多參數(shù)中的一兩個，將會達(dá)到優(yōu)化擴(kuò)增的目的。其中zui主要的優(yōu)化變量包括 Mg2＋濃度、緩沖液pH值和循環(huán)條件，在循環(huán)條件中又以退火溫度zui為重要。
1．降落PCR
降落PCR代表了一種*不同的PCR優(yōu)化方法，它不是用許多反應(yīng)管和每管用不同的試劑濃度和循環(huán)參數(shù)，而是用一個反應(yīng)管或一小組反應(yīng)管，在適合于擴(kuò)增目的產(chǎn)物而不得到人為產(chǎn)物或引物二聚體的循環(huán)條件下反應(yīng)；設(shè)計多循環(huán)反應(yīng)的程序，使相連循環(huán)的退火溫度越來越低、由于開始時的退火溫度選擇高于估計的Tm值，隨著循環(huán)的進(jìn)行，退火溫度逐漸降到Tm值，并zui終低于這個水平。這個策略有利于確保*個引物－模板雜交事件發(fā)生在zui互補(bǔ)的反應(yīng)物之間，即那些產(chǎn)生目的擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)物之間。盡管退火溫度zui終會降到非特異雜交的Tm值，但此時目的擴(kuò)增產(chǎn)物已開始幾何擴(kuò)增，在剩下的循環(huán)中一直處于主導(dǎo)地位。由于目標(biāo)是在較早的循環(huán)中避免低Tm值配對，在降落PCR中必需應(yīng)用熱啟動技術(shù)。
當(dāng)引物和模板的同源性未知時，降落PCR尤其有價值，當(dāng)引物是根據(jù)氨基酸序列設(shè)計的簡并引物時，或者擴(kuò)增多基因家族成員時，或者想進(jìn)行進(jìn)化PCR時經(jīng)常會碰到這種情況。編設(shè)降落PCR程序的目的是要設(shè)定一系列退火溫度越來越低的循環(huán)，退火溫度的范圍應(yīng)該跨越15℃左右，從高于估計Tm值至少幾度到低于它10℃左右。目前大多數(shù)的PCR儀上都可以很方便地進(jìn)行降落PCR。
2．加入增強(qiáng)劑
一系列輔助物如DMSO（1%～10%）、PEG－6000（5%～15%）、甘油（5%～20%）、非離子去污劑、甲胺酰（1.25%～10%）和牛血清蛋白（10～100μg/mL）等都可以作為增強(qiáng)劑加到反應(yīng)中以提高特異性和產(chǎn)量。
3．Mg2＋濃度調(diào)整
Mg2＋濃度是一個zui容易控制的參數(shù)，因?yàn)樗械臐舛茸兓伎梢栽诓煌姆磻?yīng)管中同時進(jìn)行。Taq dna聚合酶的供應(yīng)商現(xiàn)在除了提供標(biāo)準(zhǔn)緩沖液外還單獨(dú)提供MgCl2溶液，以簡化Mg2＋濃度的調(diào)節(jié)。一個典型的兩步優(yōu)化過程可以首先包括Mg2＋濃度增幅為0.5mmol/L的從0.5mmol/L到5mmol/L的一系列反應(yīng)；當(dāng)Mg2＋濃度范圍縮小以后再做第二輪優(yōu)化，采用幾個增幅為0.2或0.3mmol/L的Mg2＋濃度。
4．優(yōu)化退火溫度；
退火溫度的優(yōu)化首先要采用幾種方法中的一種來計算引物－模板對的Tm值，其中zui簡單的方法是Tm＝4（G+C）+2（A+T），一個單一堿基的錯配大約降低Tm值5℃。也可以采用更加復(fù)雜的公式，但實(shí)踐中由于Tm值受緩沖液中各個成分甚至引物和模板濃度的不同影響，所以任何計算的Tm值都應(yīng)該看作是大致值。進(jìn)行退火溫度的摸索時有一定間隔（2～5℃），從高到低直到低于Tm值5℃的一系列反應(yīng)可以大致估計出給定條件下的*退火溫度。
5．循環(huán)數(shù)和再擴(kuò)增；
增加循環(huán)數(shù)可以增強(qiáng)反應(yīng)物的不足時的反應(yīng)，但這樣會導(dǎo)致產(chǎn)生假帶以及富含單鏈DNA的高分子量成片產(chǎn)物。對于再擴(kuò)增，總的原則是，如果*次PCR反應(yīng)在凝膠上見到條帶，再擴(kuò)增時只能用1μl*次PCR產(chǎn)物的1：104到1：105稀釋物。
6．熱啟動PCR
把PCR混合物在顯著低于Tm值的溫度下，哪怕是作簡短的保溫，也可能產(chǎn)生引物二聚體和非特異性配對。熱啟動PCR方法則可以大大減少這些麻煩。其目標(biāo)是在*個循環(huán)中等溫度升到超過反應(yīng)物的Tm值以后才允許反應(yīng)中的一或兩種關(guān)鍵成分進(jìn)入反應(yīng)。例如在覆蓋有礦物油的小實(shí)驗(yàn)中，所有反應(yīng)管中的一種公用成分（如Taq DNA聚合酶）可以先不加，而到*個循環(huán)的變性階段溫度超過80℃以后再加。