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ISSR分子標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)原理及操作流程
點(diǎn)擊次數(shù)：1240 發(fā)布時(shí)間：2016-4-25
ISSR標(biāo)記
ISSR（inter-simple sequence repeat）標(biāo)記是一種類似RAPD，但利用包含重復(fù)序列并在3’或5’錨定的單寡聚核酸引物對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增的標(biāo)記系統(tǒng)，即用SSR引物來(lái)擴(kuò)增重復(fù)序列之間的區(qū)域。其原理具體是，ISSR標(biāo)記根據(jù)生物廣泛存在SSR的特點(diǎn)，利用在生物基因組常出現(xiàn)的SSR本身設(shè)計(jì)引物，無(wú)需預(yù)先克隆和測(cè)序。用于擴(kuò)增的引物一般為16-18個(gè)堿基序列，由1-4個(gè)堿基組成的串聯(lián)重復(fù)和幾個(gè)非重復(fù)的錨定堿基組成，從而保證了引物與基因組DNA中SSR的5’或3’末端結(jié)合，導(dǎo)致位于反向排列、間隔不太大的重復(fù)序列間的基因組節(jié)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
一、實(shí)驗(yàn)材料
不同來(lái)源的DNA(30-50ng/ul)。
二、實(shí)驗(yàn)設(shè)備
PCR儀，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，電泳裝置，凝膠成像儀。
三、試劑
1、ISSR引物：購(gòu)買(mǎi)成品或根據(jù)加拿大British Columbia大學(xué)設(shè)計(jì)的ISSR引物序列（見(jiàn)附錄）自己合成。
2、taq酶
3、10xPCR 緩沖液
4、MgCl2：25mmol/L。
5、dNTP：2.5mmol/L。
四、操作步驟：
1. 在25ul反應(yīng)體系中，加入
模板DNA 1ul (30-50ng)
ISSR引物 1ul (約5pmol)
10xPCR Buffer 2.5ul
MgCl2 2ul
dNTP 2ul
Taq酶 1單位（U）
加ddH2O 至 25ul
混勻稍離心, 加一滴（約20 ul）礦物油。
2. 在PCR儀中預(yù)變性94℃ 2分鐘, 然后循環(huán): 94℃ 1分鐘， 45℃-68℃ 40秒， 72℃ 1-2分鐘，共40輪循環(huán)。
3. 循環(huán)結(jié)束后, 72℃ 10分鐘，4℃保存。
4. 取PCR產(chǎn)物15ul加3ul上樣緩沖液(6x)于1.6% 或1.8% 瓊脂糖膠上電泳, 穩(wěn)壓50-100Ｖ（電壓低帶型整齊， 分辨率高）。
5. 電泳結(jié)束，溴化乙錠染色20分鐘。
6. 用凝膠成像儀觀察、拍照。
操作流程簡(jiǎn)圖：