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組織和細(xì)胞總RNA提?。═RIzol法）
點(diǎn)擊次數(shù)：988 發(fā)布時(shí)間：2016-5-9
TRIzol RNA 提取試劑盒是由 GIBCO BRL 公司推出提取 RNA 的產(chǎn)品，其操作方便、快捷。
（一）試劑準(zhǔn)備
1 ． TRIzol 試劑。
2 ．氯仿
3 ．異丙醇
4 ． 75% 乙醇（ DEPC H2O 配制）
5 ． DEPC H2O
（二）操作步驟
1 ． 樣品處理：
（１）培養(yǎng)細(xì)胞：收獲細(xì)胞 1-5×10 7 ，移入 1.5ml 離心管中，加入 1ml Trizol ，混勻，室溫靜置 5min 。
（２）組織：取 50-100mg 組織（新鮮或 -70 ℃ 及液氮中保存的組織均可）置 1.5ml 離心管中，加入 1ml Trizol 充分勻漿，室溫靜置５ min 。
2 ．加入 0.2ml 氯仿，振蕩 15s ，靜置 2min 。
3 ． 4 ℃ 離心， 12000g × 15min ，取上清。
4 ．加入 0.5ml 異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置 10min 。
5 ． 4 ℃ 離心， 12000g × 10min ，棄上清。
6 ．加入 1ml 75% 乙醇，輕輕洗滌沉淀。 4 ℃ ， 7500g × 5min ，棄上清。
7. 晾干，加入適量的 DEPC H 2 O 溶解（ 65 ℃ 促溶 10-15min ）。
（三）注意事項(xiàng)
1 ．樣品量和 Trizol 的加入量一定要按步驟（ 1 ）的比例，不能隨意增加樣品量或減少 Trizol 量，否則會(huì)使內(nèi)源性 RNAse 的抑制不*，導(dǎo)致 RNA 降解。
2 ．實(shí)驗(yàn)過(guò)程必須嚴(yán)格防止 RNsae 的污染。
二、總 RNA 定量
RNA 定量方法與 DNA 定量相似。 RNA 在 260nm 波長(zhǎng)處有zui大的吸收峰。因此，可以用 260nm 波長(zhǎng)分光測(cè)定 RNA 濃度， OD 值為 1 相當(dāng)于大約 40 μ g/ml 的單鏈 RNA 。如用 1cm 光徑，用 ddH 2 O 稀釋 DNA 樣品 n 倍并以 ddH 2 O 為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的 OD 260 值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度：
RNA （ mg/ml ） =40 × OD 260 讀數(shù)×稀釋倍數(shù) (n)/1000
RNA 純品的 OD 260 /OD 280 的比值為 2.0 ，故根據(jù) OD 260 /OD 280 的比值可以估計(jì) RNA 的純度。若比值較低，說(shuō)明有殘余蛋白質(zhì)存在；比值太高，則提示 RNA 有降解。