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DNA的限制性酶切及電泳分析實(shí)驗方法
點(diǎn)擊次數(shù)：3583 發(fā)布時間：2016-6-15
基本原理
限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶(水解磷酸二酯鍵)。根據(jù)酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。通常所指的DNA限制性核酸內(nèi)切酶就是Ⅱ型酶。
主要試劑
重組質(zhì)粒DNA 插入片段300bp
本實(shí)驗所用限制性核酸內(nèi)切酶為EcoRⅠ，其識別順序為：
5′----G↓AATT C----3′
3′----C TTAA↑G----5′
磷酸二脂鍵斷裂 產(chǎn)生5′粘性末端。
操作步驟
1. 反應(yīng)體系的建立：
⑴ 在一無菌1.5 ml eppendorf管中加入：
無菌雙蒸水 7 μl
10×酶切緩沖液 2 μl
質(zhì)粒DNA(100 ng/μl) 10 μl
EcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl
總體積為20μl
⑵ 輕輕混勻，12000 rpm離心5 sec。
2. 37 ℃水浴1 h。
3. 將Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通過加熱使酶失活以終止反應(yīng)。
4. 12000 rpm離心5 sec，將管蓋及管壁上的水離下。
5. 取10 μl消化產(chǎn)物，與2 μl 6×上樣緩沖液混勻，瓊脂糖凝膠電泳檢測消化效果，電泳條件：約100 V 30～60 min。
6 結(jié)果觀察。
操作注意事項：
1. 吸樣量一定要準(zhǔn)確
2. 為了不使酶污染而導(dǎo)致浪費(fèi)，zui后才加酶
3. 要求在冰上操作，并充分混勻，
4. 開啟Eppendorf管時，手不要接觸到管蓋內(nèi)面，以防污染。
5. 樣品在37 ℃與65 ℃保溫時，將離心管蓋嚴(yán)，以防水進(jìn)入管內(nèi)造成實(shí)驗失敗。
限制性內(nèi)切酶酶解中常見的問題和原因
1. DNA*沒有被限制性內(nèi)切酶切割：①限制性內(nèi)切酶失活;②DNA不純，含有SDS、有機(jī)溶劑、EDTA等;③非限制性內(nèi)切酶*反應(yīng)條件;④酶切位點(diǎn)被修飾;⑤DNA上不存在該酶的識別順序。
2. DNA切割不*：①限制性內(nèi)切酶活性下降或稀釋不正確;②DNA不純或反應(yīng)條件不佳;③酶切位點(diǎn)被修飾;④部分DNA溶液粘在管壁上;⑤酶切后DNA粘末端退火。
3. DNA片段數(shù)目多于理論值：①限制性內(nèi)切酶星號活力;②存在第二種限制性內(nèi)切酶污染;③樣品DNA中含有其它DNA。