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免疫組化技術(shù)實驗中常見問題解答
最近更新時間：2013-8-5
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1、石蠟切片和冰凍切片的比較?
（1）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，這是今天我向一老師請教得出的結(jié)論。因為作石蠟切片時要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片;但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。
（2）冰凍切片的優(yōu)點是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時不需抗原修復(fù)這一步。缺點是細胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細胞結(jié)構(gòu)，可能會使抗原彌散;切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當你買一抗時，目錄上都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。
（3）石蠟切片的優(yōu)點可以保持組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好。
2、一抗的選擇要點和技巧是什么?
（1）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈地命中目標一樣。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機體內(nèi)也可以由好幾種克隆來產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低;而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過封閉等避免）。
（2）應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等;甚至表明石蠟切片或冰凍切片。
（3）種屬反應(yīng)性的選擇（species reactivity）。這一點很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內(nèi)的抗原。
（4）種屬來源，一般兔來源的多是多克隆;而小鼠來源的多是單克隆，但也有另外。根據(jù)此來源來選擇相應(yīng)的二抗。
（5）生產(chǎn)廠家的選擇。如santa Cruz公司抗體一般1ml，價格2100元左右;而chemicon公司一抗一般100ul，價格2800元左右。這兩個廠家的同一種抗體它的實際效價穩(wěn)定是不同的，我一般用后者抗體做免疫組化效果較好，而前者做Western blotting效果還可以。
3、在什么情況下使用Triton-X100
（1）Triton X-100化學(xué)名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(xué)（>10um厚切片） 和免疫細胞化學(xué)中一般用Triton X-100 作為細胞通透劑，在膜上打孔。
（2）其作用原理：Triton X-100 可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進入胞漿和胞核內(nèi)，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。
（3）Triton X-100既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。
4、封閉血清的選擇原則是什么?
（1）膜上或切片上有剩余的位點可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性!
（2）封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合，會造成背景。
（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。
5、抗體孵育條件的比較?
（1）一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果*;孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，而4度過和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。
（2）二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索。
6、一抗4度孵育后為什么要進行37度復(fù)溫?
（1）一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片;
（2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要，但對表達較弱的抗原可能有用，4度和37度時分子運動方式不同，前者分子碰撞機率和運動速度小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。
（3）其實，我更贊同后一種說法，因為我嘗試把肝臟或睪丸片子從4度過拿出后，直接用PBS洗沒發(fā)生過脫片現(xiàn)象。事實勝于雄辯!
7、DAB顯色時間如何把握?
（1）DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現(xiàn)淺棕色本底時即可沖洗;
（2）DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間;
（3）此外，若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間;
（4）DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（一抗4度過）;另一方面就是封閉時間過長。
8、免疫組化結(jié)果如何分析?
（1）陽性著色細胞計數(shù)法。在40*光鏡下，隨機選擇不重疊的10個視野，人工或機器計數(shù)陽性著色細胞，每組3~6張不同動物組織切片，然后進行組間比較即可。
（2）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用image j進行灰密度分析，然后進行統(tǒng)計分析即可。
（3）評分法。通過在光學(xué)顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0~3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進行評分（1~4分為0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），zui終可以分數(shù)相加，再進行比較。
對于以上這幾種方法，各有利弊，請細心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。
9、在什么情況下進行組織抗原修復(fù)，抗原修復(fù)的條件是什么?
（1）由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過抗原修復(fù)，使得細胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。
（2）修復(fù)方法從強到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH的等）。
（3）微波修復(fù)，我們一般用6min*4次，效果不錯。