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蛋白質(zhì)鑒定方法銀染法和考馬斯亮藍(lán)染色法

最近更新時(shí)間：2013-8-26

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相關(guān)產(chǎn)品：

 常用的蛋白質(zhì)染色試劑分為已考馬斯亮藍(lán)為代表的有機(jī)試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色。其中考馬斯亮藍(lán)染色法的應(yīng)用較為廣泛，現(xiàn)將其與其他的蛋白質(zhì)染色方法（主要是銀染法）作一比較，幫助大家更好地去選擇合適的蛋白質(zhì)染色方法。

蛋白質(zhì)的染色常用的有4類：有機(jī)試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色。其中有機(jī)試劑染色以考馬斯亮藍(lán)染色法（Coomasie brilliant blue，CBB）為代表，在蛋白質(zhì)分析中常用，但對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的顯現(xiàn)較差;銀染靈敏度雖高，卻常與質(zhì)譜不兼容;熒光染色以SYPRO試劑為主，蛋白質(zhì)檢測(cè)靈敏度高，能兼容質(zhì)譜，但由于需要配備特殊的檢測(cè)儀器及試劑的昂貴，未被作為常規(guī)方法使用;而同位素顯色則存在安全性和操作局限性等問(wèn)題。因此，篩選簡(jiǎn)便、節(jié)約、檢測(cè)靈敏度高、質(zhì)譜兼容的蛋白質(zhì)著色法是蛋白質(zhì)組研究所需。由于考馬斯亮藍(lán)染色法的廣泛運(yùn)用，近年來(lái)就考馬斯亮藍(lán)染色法在提高其靈敏性方面研究者們作了許多改進(jìn)，方法眾多，評(píng)價(jià)不一。

我們?cè)谧麟p向凝膠電泳時(shí)，將常用的幾種考馬斯亮藍(lán)染色法及銀染進(jìn)行了比較，并就其染色影響因素作出分析。

試劑

固相pH梯度干膠條（IPG strip pH3-10NL，IPG strip pH5-8，17cm）、urea、CHAPS、TBP、DTT、Bio-Lyte 3/10 Ampholyte、IAM、SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、CBB-G250均為BIO-RAD公司產(chǎn)品。硫酸銨及磷酸均購(gòu)自成都科龍?jiān)噭S。AgNO3為Sigma公司出品。Protein molecular weight marker #SW0431為MBI公司出品。甲醛、Na2S2O3與Na2CO3分別為成都天華科技股份有限公司、重慶北碚化學(xué)試劑廠和天津市塘沽鵬達(dá)化工廠產(chǎn)品。

儀器

IPGphor等電聚焦儀、proTEANⅡ垂直電泳儀、Power PAC1000電泳儀、加樣溶脹槽、GS-800 Calibrated Densitometer掃描儀、PDQuest凝膠圖像分析軟件均為BIO-RAD公司產(chǎn)品。

細(xì)胞總蛋白質(zhì)的提取

取4份經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)的急性早幼粒白血病細(xì)胞株（NB4）1×107細(xì)胞各重懸于350 μl蛋白質(zhì)裂解緩沖液中（8mol/L Urea，2g/L CHAPS，2mmol/L TBP，2ml/L Carrier Ampholyte，痕量溴酚蘭），置冰浴中超聲裂解，靜置30分鐘，15500×g離心30分鐘，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。

單向定量電泳

取蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物，*次按1∶2稀釋后，以后按1∶3倍比例逐級(jí)稀釋，經(jīng)4級(jí)稀釋后，取15μl上樣液上樣，β-半乳糖苷酶上樣量依次分別為1μg、 0.24μg、0.062μg、0.0156μg、0.004μg。作12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠單向電泳，同時(shí)電泳4份膠，顯色以確定染色靈敏度。

雙向電泳

取 300μl樣品液沿水化盤中槽的邊緣自左向右線性加入，將17cm IPG膠條膠面朝下置于槽中，靜置45分鐘后覆蓋礦物油，在20℃溶脹11～16小時(shí)。溶脹后的膠條置于等電聚焦盤中，在Protean IEF Cell中進(jìn)行等電聚焦，溫度設(shè)置為20℃，電壓模式設(shè)置為：快速升壓，250 V，0.5小時(shí);500 V，0.5小時(shí);10000 V，60000 Vh（伏特×小時(shí)）。取IEF后的IPG 膠條，先后分別置于含DTT平衡液1（6mol/L urea，2g/L SDS，0.05mol/L Tris pH 8.8，200ml/L gylcecol，2g/L）及含碘乙酰胺平衡液2（同平衡液1，但其中DTT換為2.5g/L 碘乙酰胺）中輕微搖蕩各10分鐘。將平衡好的IPG 膠條置于預(yù)先灌制的12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，封固，在15℃低溫水循環(huán)條件下，15 mA/gel電泳15分鐘，然后以25mA/gel恒流電泳。

顯色

取出SDS-聚丙烯酰胺凝膠，經(jīng)超純水清洗2次，每次1分鐘，4塊膠分別按4種不同的染色方法顯色。下列每步操作皆在搖床上進(jìn)行。4種染色法成份組成及操作如下： ①傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法：清洗后的凝膠經(jīng)固定液（45.4%甲醇、4.6%乙酸）固定1小時(shí)，隨后用染色液（45.4%甲醇、4.6%乙酸、0.1% CBB G250）著色過(guò)，再經(jīng)洗脫液（5%甲醇、7.5%乙酸）過(guò)脫色至背景清晰。②膠體考馬斯亮藍(lán)染色法（colloidal Coomassie brilliant blue，cCBB）染色法：凝膠先經(jīng)超純水漂洗后，再用colloidal Coomassie blue G250染色液（1.6%磷酸、8%硫酸銨、0.02% CBB G250、20%乙醇）著色過(guò)，洗脫液為超純水，換液3～4次直至背景清晰。③改良考馬斯亮藍(lán)染色法（modified Coomassie brilliant blue，mCBB）染色法[6];操作方法同膠體考馬斯亮藍(lán)染色法，只是染色液組成不同（0.12% CBB G250、10%硫酸銨、10%磷酸、20%乙醇），著色1小時(shí)即可。④銀染（silver staining）：凝膠漂洗后先被固定液（50%甲醇+ 5%乙酸）固定1小時(shí)，隨后分別用50%甲醇和超純水清洗各10分鐘，0.02 mg/L Na2S2O3 致敏1分鐘，超純水清洗2次，每次1分鐘，再用預(yù)冷的0.15% AgNO3著色20分鐘，超純水再次清洗2次，每次1分鐘，2% Na2CO3 + 0.04% 甲醛顯色20～30秒，當(dāng)溶液變黃以后除去，換新鮮的溶液后繼續(xù)顯色直至顯色適度后，以5%乙酸終止顯色。

成像、分析、質(zhì)譜鑒定

脫色后，凝膠經(jīng)GS-800 Calibrated Densitometer掃描成像，用PDQuest軟件進(jìn)行分析。切取蛋白質(zhì)點(diǎn)，胰酶消化，行質(zhì)譜鑒定。

結(jié)果

4種染色法的蛋白質(zhì)檢測(cè)靈敏性分析

β-半乳糖苷酶的上樣量依次分別為1、0.24、0.062、0.0156和0.004μg。經(jīng)傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色后的條帶在62ng水平隱隱可見(jiàn);而膠體考馬斯亮藍(lán)染色法的靈敏度稍高，62ng條帶明顯可見(jiàn);改良考馬斯亮藍(lán)染色法的效果更好些，在15.6ng水平可見(jiàn)條帶的顯示;而銀染法靈敏度zui高，在15.6ng水平可見(jiàn)清晰條帶的顯現(xiàn)，同時(shí)在4ng可見(jiàn)隱約條帶。4種染色法的比較顯示，靈敏度zui高的是銀染法，可達(dá)納克級(jí)水平，其次為改良考馬斯亮藍(lán)染色法，10納克級(jí)蛋白質(zhì)能被檢測(cè)。而膠體考馬斯亮藍(lán)染色法和經(jīng)典考馬斯亮藍(lán)染色法稍差，檢測(cè)水平僅達(dá)幾十納克。

4種染色法的雙向電泳蛋白質(zhì)點(diǎn)顯示比較

來(lái)自NB4細(xì)胞的全蛋白經(jīng)pH 3-10NL的等電點(diǎn)梯度分離，SDS-PAGE 二維垂直電泳后被3種考染法著色成像的顯示可以看出傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法的蛋白質(zhì)點(diǎn)顯現(xiàn)zui少，膠體考馬斯亮藍(lán)染色法的蛋白質(zhì)點(diǎn)顯現(xiàn)較多，而改良考馬斯亮藍(lán)染色法的蛋白質(zhì)點(diǎn)顯現(xiàn)更多。凝膠背景以后二者為更清晰。經(jīng)PDQuest軟件進(jìn)行分析，3幅圖的蛋白質(zhì)點(diǎn)顯現(xiàn)數(shù)分別為483、679、890。NB4細(xì)胞的全蛋白經(jīng)pH 5-8 IPG分離，分別經(jīng)改良考馬斯亮藍(lán)染色法與銀染法著色成像的蛋白點(diǎn)顯示，二者上樣量一致，蛋白點(diǎn)的顯現(xiàn)數(shù)量相當(dāng)，但銀染的蛋白點(diǎn)明顯顯示著色重。這與單向電泳的效果相同。

4種染色法的可操作性比較

在比較其蛋白質(zhì)檢測(cè)靈敏性的同時(shí)，對(duì)染色法的操作簡(jiǎn)便性、安全性以及蛋白質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜鑒定的成功率也作了對(duì)比。比較顯示，考馬斯亮藍(lán)染方法簡(jiǎn)便，但耗時(shí)較長(zhǎng)，經(jīng)改進(jìn)后可以做到無(wú)毒操作，質(zhì)譜兼容性較高。銀染步驟繁多，但耗時(shí)短;操作過(guò)程中有甲醇、甲醛等毒性物的接觸，質(zhì)譜兼容性低。即使我們選擇的銀染法被文獻(xiàn)報(bào)道為質(zhì)譜兼容的，但仍然表現(xiàn)為低的蛋白鑒定率，不及考馬斯亮藍(lán)染。

討論

凝膠染色方法對(duì)蛋白質(zhì)分辨率的影響

提高雙向凝膠電泳的分辨率是蛋白質(zhì)組學(xué)研究尚待解決的課題及技術(shù)發(fā)展方向，影響蛋白質(zhì)分辨率的因素較多，其中凝膠染色方法對(duì)蛋白質(zhì)分辨率的影響不可忽視，它影響了實(shí)驗(yàn)的顯像結(jié)果，直接干預(yù)了后續(xù)的質(zhì)譜鑒定。目前，在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的是考馬斯亮藍(lán)染色法和銀染法兩種。

考馬斯亮藍(lán)（Coomassie brilliant blue，CBB G-250）的化學(xué)名稱為二甲花青亮藍(lán)，偏酸性，與蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)結(jié)合，顏色由棕黃色轉(zhuǎn)為深蘭色?？捡R斯亮藍(lán)染色法可以達(dá)到微克級(jí)檢測(cè)水平，著色程度與蛋白量的線性動(dòng)力學(xué)相關(guān)范圍廣，適合定量分析。該法由于較低的成本、使用方便及與下游的質(zhì)譜鑒定技術(shù)的良好相容性，而得到了非常廣泛的使用。然而微克級(jí)的檢測(cè)水平使它漏檢了相當(dāng)多的低豐度蛋白質(zhì)，日益成為蛋白質(zhì)組學(xué)的瓶頸，因此大量提高染色靈敏度的研究及各種染色液的配方和方法應(yīng)運(yùn)而生，經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道的方法眾多，評(píng)價(jià)不一。我們的試驗(yàn)選擇了3種常用的考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行比較，測(cè)得傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法的靈敏度可達(dá)幾百納克，膠體考馬斯亮藍(lán)染色法能檢測(cè)到幾十納克蛋白，改良考馬斯亮藍(lán)染色法則可達(dá)幾納克蛋白水平?？捡R斯亮藍(lán)染色法經(jīng)過(guò)改進(jìn)能獲得高的蛋白質(zhì)檢測(cè)靈敏度，甚至可與銀染媲美。

銀染法是利用銀離子與氨基酸共價(jià)結(jié)合，還原劑的加入使與膠內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合的銀離子形成金屬銀而顯色。文獻(xiàn)報(bào)道檢測(cè)限度可低于1 ng的蛋白質(zhì)，其靈敏度比傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法高約100倍，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究，但銀染步驟復(fù)雜，繁瑣，且著色線性動(dòng)力學(xué)的覆蓋范圍窄，導(dǎo)致蛋白質(zhì)差異顯示的不準(zhǔn)確性，同時(shí)由于游離銀離子及相關(guān)試劑的存在，給后續(xù)分析及鑒定帶來(lái)一定的實(shí)際困難。我們的實(shí)驗(yàn)只采用了一種銀染法，結(jié)果顯示銀染法的靈敏性高于所有考馬斯亮藍(lán)染色法，4 ng的蛋白質(zhì)條帶也能顯現(xiàn)，但蛋白質(zhì)鑒定成功率低。

蛋白質(zhì)檢測(cè)靈敏度的影響因素

蛋白質(zhì)著色顯示的靈敏性既取決于染色試劑，如上述分析，又與染色過(guò)程中涉及的有機(jī)溶劑及離子有關(guān)。在考馬斯亮藍(lán)染色法和銀染法中都存在如甲醇、乙醇、乙酸、甲醛等有機(jī)溶劑的使用。甲醇和乙醇在染色里起固定作用，把蛋白質(zhì)固定在凝膠中或阻滯它們?cè)谀z中擴(kuò)散。同時(shí)也去除電泳過(guò)程中的干擾染色過(guò)程的物質(zhì)，如去垢劑、還原劑和緩沖液等成分。乙酸的作用既是輔助固定蛋白質(zhì)同時(shí)又維持染液的酸性度，以利于考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)結(jié)合。他們的存在有利于獲得背景清晰、信噪比高的圖像。由于3種有機(jī)溶劑的相似作用，我們?cè)谀z體考馬斯亮藍(lán)染色法及改良考馬斯亮藍(lán)染色法里，保留乙醇作為*的固定清潔劑，用磷酸替代乙酸發(fā)揮酸化作用，結(jié)果顯示兩種考馬斯亮藍(lán)染色法獲得的圖像背景比傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法的要清晰，條帶也銳利。

在膠體考馬斯亮藍(lán)染色法中，酸性的乙醇介質(zhì)中加入硫酸銨，使得著色劑形成膠體染色顆粒，膠本身可不被顯著著色，蛋白染色靈敏度得以提高。而在改良考馬斯亮藍(lán)染色法中，在高酸、高離子環(huán)境下，蛋白質(zhì)的葡糖胺和天冬酰胺酸質(zhì)子化，更利于與染色劑發(fā)生結(jié)合。因此2種染色法呈現(xiàn)出背景清晰、蛋白檢測(cè)多的圖像，且在改良考馬斯亮藍(lán)染色法中由于高酸、高離子存在，靈敏度出現(xiàn)提高，幾接近銀染水平。

甲醛在銀染中發(fā)揮還原劑作用，使結(jié)合在蛋白質(zhì)上的銀還原而顯色。甲醛濃度影響銀染效果，濃度一般為400～500μl/L。甲醛濃度較高時(shí)膠顏色發(fā)黃，背景色混雜，難以發(fā)現(xiàn)目的點(diǎn);濃度較低不僅染色時(shí)間延長(zhǎng)，而且不易著色。銀的絡(luò)合劑硫代硫酸鈉防止自由銀離子還原為金屬銀，可減少非特異染色，降低背景染色，其濃度一般為0.1～0.2mg/L。該絡(luò)合劑用量過(guò)多，膠顏色過(guò)深;少則不足以螯合掉游離的銀離子，膠顏色發(fā)黑。

質(zhì)譜兼容性的影響因素

考馬斯亮藍(lán)G-250在一定的pH時(shí)，這種染料-蛋白質(zhì)復(fù)合物被*解聚。適應(yīng)于蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定;而銀染使用的銀離子及醛類造成肽間的相互交連，影響膠內(nèi)蛋白質(zhì)酶解及洗脫，降低了蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的氨基酸序列覆蓋率，考馬斯亮藍(lán)染蛋白質(zhì)鑒定的成功率在60%～80%之間，遠(yuǎn)高于銀染鑒定的成功率（30%～60%）;而我們的結(jié)果是，前者的質(zhì)譜鑒定成功率為50%，后者僅為5%。鑒于此，我們也在不斷地尋找新的方法，以提高銀染鑒定的成功率。

操作的安全性與簡(jiǎn)便性

由于有機(jī)溶劑的相似作用，我們?cè)诟倪M(jìn)的考馬斯亮藍(lán)染色法里，拋棄有毒的甲醇及氣味難聞的乙酸，同時(shí)在步驟上，我們采用染色和固定一步法進(jìn)行，減少了*步固定的時(shí)間，僅用超純水清洗，縮短了整個(gè)染色及人與有毒物接觸的時(shí)間。結(jié)果顯示，兩種考馬斯亮藍(lán)染色法獲得的圖像背景不比傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法差。

通過(guò)我們的摸索及比較分析認(rèn)為，用低毒的乙醇替代甲醇，采用高酸、高離子、快速而簡(jiǎn)便的改良考馬斯亮藍(lán)染色法能獲得低背景、高靈敏度、兼容質(zhì)譜的蛋白質(zhì)顯示，能為蛋白質(zhì)組研究、雙向凝膠電泳技術(shù)的蛋白質(zhì)分析提供質(zhì)量的保證。

綜上比較，作為蛋白質(zhì)染色的方法，考馬斯亮藍(lán)法操作便捷、兼容性高，但耗時(shí)較長(zhǎng)。經(jīng)改良的考馬斯亮藍(lán)法的檢測(cè)靈敏性大大提高，甚至不輸銀染法。而銀染法雖然耗時(shí)短，但步驟較多，且兼容性低。

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