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士鋒生物酵母單雜交技術的原理、基本操作和用途
最近更新時間：2013-8-28
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大小：37KB
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酵母單雜交技術是一種研究蛋白質和特定DNA序列相互作用的技術方法，主要包括四個流程即：一、篩選還有報告基因的酵母單細胞株；二、構建表達文庫；三、重組質粒轉化至酵母細胞；四、陽性克隆菌株的篩選。
1.酵母單雜交的基本原理
酵母單雜交技術是1993年由酵母雙雜交技術發(fā)展而來的，其基本原理為：真核生物基因的轉錄起始需轉錄因子參與，轉錄因子通常由一個DNA特異性結合功能域和一個或多個其他調控蛋白相互作用的激活功能域組成，即DNA結合結構域（DNA—bindingdomain，BD）和轉錄激活結構域（activationdomain，AD）。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉錄因子，GAL4的DNA結合結構域靠近羧基端，含有幾個鋅指結構，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點（UAS），而轉錄激活結構域可與RNA聚合酶或轉錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結合結構域和轉錄激活結構域可*獨立地發(fā)揮作用。據此，我們可將GAL4的DNA結合結構域置換為文庫蛋白編碼基因，只要其表達的蛋白能與目的基因相互作用，同樣可通過轉錄激活結構域激活RNA聚合酶，啟動下游報告基因的轉錄。
酵母單雜交原理示意圖
2.酵母單雜交技術的特點
酵母單雜交體系自1993年由Wang和Reed創(chuàng)立以來，在生物學研究領域中已經顯示出巨大的威力。應用酵母單雜交體系已經驗證了許多已知的DNA與蛋白質之間的相互作用，同時發(fā)現(xiàn)了新的DNA與蛋白質的相互作用，并由此找到了多種新的轉錄因子。近來，已有應用酵母單雜交體系進行疾病診斷的研究報道。隨著酵母單雜交體系的不斷發(fā)展和完善，它在科研、醫(yī)療等方面的應用將會越來越廣泛。采用酵母單雜交體系能在一個簡單實驗過程中，識別與DNA特異結合的蛋白質，同時可直接從基因文庫中找到編碼蛋白的DNA序列，而無需分離純化蛋白，實驗簡單易行。由于酵母單雜交體系檢測到的與DNA結合的蛋白質是處于自然構象，克服了體外研究時蛋白質通常處于非自然構象的缺點，因而具有很高的靈敏性。目前，多種酵母單雜交體系的試劑盒和相應的cDNA文庫已經商品化，為酵母單雜交體系的使用提供了有利的條件。
但酵母單雜交也存在以下缺點：有時由于插入的靶元件與酵母內源轉錄激活因子可能發(fā)生相互作用，或插入的靶元件不需要轉錄激活因子就可以激活報告基因的轉錄，因此往往產生假陽性結果。如果酵母表達的AD融合蛋白對細胞有毒性，或融合蛋白在宿主細胞內不能穩(wěn)定地表達，或融合蛋白發(fā)生錯誤折疊，或者不能定位于酵母細胞核內，以及融合的Gal4AD封閉了蛋白質上與DNA相互作用的位點，則都可能干擾AD融合蛋白結合于靶元件的能力，從而產生假陰性結果。
3.酵母單雜交的基本操作過程
（1）設計含目的基因（稱為誘餌）和下游報告基因的質粒，并將其轉入酵母細胞。
（2）將文庫蛋白的編碼基因片段與GAL4轉錄激活域融合表達的cDNA文庫質粒轉化人同一酵母中。
（3）若文庫蛋白與目的基因相互作用，可通過報告基因的表達將文庫蛋白的編碼基因篩選出來。在這里作為誘餌的目的基因就是啟動子DNA片段，文庫基因所編碼的蛋白就是啟動子基因結合蛋白。
4.酵母單雜交技術的用途
迄今為止，應用酵母單雜交體系已經識別并驗證了許多與目的DNA序列結合的蛋白質，同時單雜交技術還被應用于識別金屬反應結合因子。正向與反向單雜交體系的結合，還可用于篩選阻礙DNA與蛋白質相互作用的突變的單個核苷酸。
目前，在研究DNA—蛋白質相互作用中，酵母單雜交體系主要有以下3種用途：①確定已知DNA—蛋白質之間是否存在相互作用;②分離結合于目的順式調控元件或其他短DNA結合位點蛋白的新基因;③定位已經證實的具有相互作用的DNA結合蛋白的DNA結合結構域，以及準確定位與DNA結合的核苷酸序列。
酵母單雜交是在酵母雙雜交的基礎上發(fā)展起來的技術，酵母單雜交主要用于研究蛋白質和DNA的相互作用，而酵母雙雜交主要是用于研究蛋白質間的相互作用。