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士鋒生物轉(zhuǎn)染DEAE-葡聚糖介導(dǎo)實驗步驟
最近更新時間：2013-10-16
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>13.6KB
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士鋒生物轉(zhuǎn)染DEAE-葡聚糖介導(dǎo)實驗步驟，通過內(nèi)吞噬作用而使DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核，此法只適合暫時轉(zhuǎn)染實驗，轉(zhuǎn)染效率與DEAE-葡聚糖濃度以及細(xì)胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關(guān)系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖（1g/L）作用較短時間（30分鐘-1.5小時），又可用較低濃度（250g/L）的DEAE-葡聚糖作用較長時間（8小時）。
方法如下：
1. 接種鼠L成纖維細(xì)胞濃度為5×105CO2 /孔/皿生長2～3天，當(dāng)達(dá)50%板底面積可用。
2. 乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo質(zhì)粒dna，空氣干燥后溶于40μL的TE中，或取供體DNA。
3. 用10ml 1×PBS、4mL、10%富合生長因子血清的DMEM洗板（皿）。
4. 在80μl熱的10g/L DEAE-葡聚糖中緩慢加入DNA，取120μL DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔（皿）細(xì)胞中，使其分布均勻輕輕轉(zhuǎn)動直到顯示均勻一致的紅色，培養(yǎng)4小時。
5. 從孔（皿）中吸出DNA/DEAE-葡聚糖，加入5mL 10%DMSD，室溫放置1分鐘，吸出DMSO，用5mL 1×PBS洗一次吸出，加入10mL培養(yǎng)液（10%血清的DMEM）。
6. 培養(yǎng)細(xì)胞，在適當(dāng)時間分析細(xì)胞，若含有抗藥基因，可用G418選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)。