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士鋒生物mRNA/siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)介紹
最近更新時(shí)間：2013-10-22
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大小：14.3KB
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RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)是將RNA分子如mRNA、sirna、病毒RNA等導(dǎo)入細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)的過(guò)程。RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)主要用于研究RNA的功能，其中miRNA的轉(zhuǎn)染已經(jīng)成功應(yīng)用于抑制目的基因的表達(dá)及其功能研究中。
不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)都是為了滿足不同的實(shí)驗(yàn)需要，RNA轉(zhuǎn)染提供了另一種有別于DNA轉(zhuǎn)染的研究探索手段——直接將體外翻譯的RNA、或者病毒RNA、或RNA oligos，或siRNA、甚至核糖體利用轉(zhuǎn)染技術(shù)帶入細(xì)胞中。由于不需要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄即可直接翻譯，RNA轉(zhuǎn)染得到的結(jié)果比DNA轉(zhuǎn)染更快更直接，當(dāng)然于瞬時(shí)表達(dá)。RNA轉(zhuǎn)染的這些特性很適合某些研究：比如處于非分裂期的細(xì)胞轉(zhuǎn)染或者很難用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，RNA病毒的研究，反義RNA的轉(zhuǎn)染，sirna轉(zhuǎn)染（RNA干擾）等等。
影響rna轉(zhuǎn)染的因素
既然都是核酸，傳統(tǒng)的DNA轉(zhuǎn)染方法都可以用來(lái)轉(zhuǎn)染RNA，不過(guò)zui頭疼的就是RNA容易降解和防止RNAse污染。
RNA操作要注意的事項(xiàng)我們就不用羅嗦了，轉(zhuǎn)染中要額外注意的就是轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)該是確認(rèn)無(wú)RNase污染的，而且也盡量避免和質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染混用——即使試劑本身兼容DNA和RNA轉(zhuǎn)染，你也要想到人家做質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染時(shí)往往不會(huì)這么小心，難免將污染混入，那你豈不是很冤?多數(shù)情況下轉(zhuǎn)染試劑都不建議自己分裝，因?yàn)椴煌墓懿目赡軙?huì)影響轉(zhuǎn)染試劑的穩(wěn)定性，那就更得不償失了。所以RNA的轉(zhuǎn)染試劑會(huì)更好一些。還有重要的一點(diǎn)就是要采用無(wú)RNAse污染的血清。
轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞匯合度常常會(huì)比DNA轉(zhuǎn)染高一點(diǎn)，也許是因?yàn)镽NA轉(zhuǎn)染表達(dá)比DNA快?RNA轉(zhuǎn)染的用量必須參考轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明，因?yàn)镽NA和轉(zhuǎn)染試劑的比例決定了轉(zhuǎn)染復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和凈電荷，以及是否容易被細(xì)胞膜吸附和內(nèi)吞。RNA少了固然表達(dá)不好，太多也會(huì)有毒性的問(wèn)題。有的品牌轉(zhuǎn)染試劑有促核酸凝聚的試劑，幫助核酸折疊為較為致密的結(jié)構(gòu)。如果轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞沒(méi)有太大影響，轉(zhuǎn)染復(fù)合物和細(xì)胞共同孵育的時(shí)間越長(zhǎng)當(dāng)然越好。不過(guò)，如果RNA本身帶有熒光標(biāo)記的化，檢測(cè)前通常要洗掉多余的RNA以免干擾結(jié)果。
除了操作，RNA本身的結(jié)構(gòu)也對(duì)轉(zhuǎn)染有一定的影響。哺乳動(dòng)物的mRNA分子帶有5'端帽子結(jié)構(gòu)和3'端PolyA尾巴，此外還有成為IRES（internal ribosomal entry site）的核糖體結(jié)合區(qū)，這些結(jié)構(gòu)或者有助于提高mRNA的穩(wěn)定性，或者有助于核糖體結(jié)合到mRNA上進(jìn)行翻譯。對(duì)于體外轉(zhuǎn)錄得到RNA可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)加入模擬RNA5'端帽子結(jié)構(gòu)類似物而獲得這個(gè)保護(hù)性的“帽子”（Ambion公司有提供的），3'端PolyA尾巴也可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)添加。多數(shù)情況下添加這些元件有助于提高RNA進(jìn)入細(xì)胞后的穩(wěn)定性。但是有時(shí)候IRES元件促進(jìn)翻譯的進(jìn)行，而到有的細(xì)胞株中，由于缺乏相應(yīng)的結(jié)合蛋白，IRES反而影響轉(zhuǎn)錄。這個(gè)在RNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中是要格外注意的。RNA干擾實(shí)驗(yàn)中的siRNA結(jié)構(gòu)對(duì)基因沉默效果也有影響，比如推薦添加的AA（N19）TT結(jié)構(gòu)（AA（N21）或者CA（N21）也是可以的）。這就不在轉(zhuǎn)染的討論范圍內(nèi)了。
RNA轉(zhuǎn)染過(guò)程中的影響因素比較多，如RNA的機(jī)構(gòu)、RNA轉(zhuǎn)染時(shí)RNA的用量、RNase的污染、進(jìn)入細(xì)胞后RNA的降解等因素使RNA的轉(zhuǎn)染過(guò)程更加復(fù)雜、給轉(zhuǎn)染結(jié)果帶來(lái)影響，其中RNA在轉(zhuǎn)入細(xì)胞后的降解問(wèn)題在RNA轉(zhuǎn)染過(guò)程中是比較重要的，如果轉(zhuǎn)染的RNA在進(jìn)入細(xì)胞體后大量降解，那么實(shí)驗(yàn)結(jié)果就很不準(zhǔn)確了。