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士鋒生物細(xì)胞復(fù)蘇后貼壁細(xì)胞較少的問題分析
最近更新時間：2013-10-29
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>14.3KB
文件類型：JPG 圖片下載次數(shù)：114次
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詳細(xì)介紹：
疑問：以前拿回細(xì)胞后，傳代、凍存后復(fù)蘇過幾次都沒什么問題，zui近因?qū)嶒炇曳跸湮廴?，清潔消毒?xì)胞室后，重新復(fù)蘇，結(jié)果連續(xù)復(fù)蘇6支，細(xì)胞均未貼壁，今晚復(fù)蘇6小時后觀察有一瓶相對貼壁細(xì)胞數(shù)較之前復(fù)蘇失敗瓶多，但貼壁細(xì)胞狀態(tài)不好，形態(tài)不佳，透光度亦不好!急求各位大俠會診指導(dǎo)!
分析1:復(fù)蘇過程沒有問題，是否是從液氮拿出直接放入溫水，還有培養(yǎng)箱，二氧化碳濃度，培養(yǎng)基、PH值等環(huán)節(jié)。要么加高濃度FBS 15-20%，看看能否幫助貼壁，當(dāng)然也需要考慮血清問題，還有確信拿來的細(xì)胞沒問題。
分析2:首先應(yīng)該懷疑凍存，實際上復(fù)蘇出問題的可能非常小，因為操作簡單，而且死板。
1、你凍存的時候是不是消化的時間過長，這是一般人所注意不到的，即使書上也不講這個問題，但我因為這個問題就兩種肺癌細(xì)胞和一種肝癌細(xì)胞專門做過試驗，這個是絕大部分人細(xì)胞復(fù)不活的一個原因。太長的消化時間會讓細(xì)胞復(fù)蘇時失去貼壁能力，表現(xiàn)為先貼后死，原因是在你復(fù)蘇的時候細(xì)胞已進(jìn)入凋亡程序，不可逆轉(zhuǎn)的死亡。
2、你的凍存液好不好，是什么，甘油還是DMSO，質(zhì)量非常重要，否則也會死亡。
3、你的凍存液的量加的是不是太多，ATCC推薦是不超過7%，大于5%，太多也不好。
4、你在凍存的時候是不是把DMSO混均勻，這個有一些影響，但不算太大。
5、你的凍存是否按部就班，就是所溫度梯度是不是把握嚴(yán)格，很多人容易忘卻這個事情，因為這個東西流程長。
6、如果你細(xì)胞污染，你是否能很快看到，我比我的導(dǎo)師能早一天看到污染。從這個角度講建議去除離心這步。
7、你的細(xì)胞在凍存前是否過密。
還有，不贊成孵箱污染這個概念的，所有在一個孵箱里的細(xì)胞都污染一個細(xì)菌的話，這個細(xì)菌是源于孵箱的，但這不代表孵箱污染，因為孵箱無論你如何處理都有大量的細(xì)菌，問題在操作。我們的細(xì)胞房不換拖鞋，非常臟，別人的細(xì)胞都污染，很多細(xì)胞都污染到絕種，但我的只污染一次（兩年內(nèi)只有兩瓶），那次是因為別人給我動了，我每次細(xì)胞擺放順序都是記住的。如果你老懷疑孵箱污染，那說明你在養(yǎng)細(xì)胞這方面很差。
每次污染的原因都要盡可能的找，以后就不犯同樣的問題，這個很重要，不能靠猜，否則你就有可能細(xì)胞養(yǎng)絕zui后換課題，這個見得太多了，別不當(dāng)會事。