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士鋒生物補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)分析報(bào)告

最近更新時(shí)間：2013-12-3

提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>14.3KB

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相關(guān)產(chǎn)品：

【原理】
補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)（complement dependent cytotoxicity test）的原理是特異性抗體與細(xì)胞膜上相應(yīng)抗原結(jié)合后，在補(bǔ)體的參與下，可產(chǎn)生細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞死亡；不帶相應(yīng)抗原的細(xì)胞仍然存活。利用染料排斥實(shí)驗(yàn)判定淋巴細(xì)胞死活狀態(tài)，活細(xì)胞不著色，具有折光性，大小也正常。死細(xì)胞著色，體積增大。下面以HLA-A、B、C抗原檢測(cè)為例。
【材料】
1.Terasaki塑料板（60孔或96孔）、Fisher離心管、Fisher離心機(jī)、水平式離心機(jī)、倒置顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、普通顯微鏡、毛吸滴管、大試管、中試管、橡皮乳頭、溫箱、火花真空檢測(cè)器。
2.肝素抗凝劑（1000U/0.5ml/管）、Hanks液（pH7.2）、McCoy培養(yǎng)基、淋巴細(xì)胞分離液（比重1.077）、50 g/L 伊紅 Y、34-40%中性甲醛、生理鹽水、凝血酶。
3.兔補(bǔ)體 20只以上兔的新鮮血清混合而成，分裝于滅菌青霉素小瓶?jī)?nèi)。在無HLA抗血清時(shí)應(yīng)無淋巴細(xì)胞毒性；1；2稀釋應(yīng)仍能使分型血清反應(yīng)結(jié)果記分為8分（見本實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定）。不稀釋，-70℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。用前半小時(shí)，取出室溫融化，使用后剩余液棄去，不得反復(fù)凍融。
4.淋巴細(xì)胞懸液
（1）取肝素抗凝外周血10~15ml，1800rpm 離心10~15min。
（2）取白細(xì)胞層（1.0~1.5ml）加至含1.5 ml hanks液的中試管中。
（3）用毛吸滴管混勻，輕輕沿管壁加在盛有1.5 ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，使之重疊于淋巴細(xì)胞分離液上，分層良好。
（4）2000 rpm 離心20min。
（5）吸取單個(gè)核細(xì)胞層細(xì)胞，加入Fisher離心管中，用Fisher離心機(jī)4000rpm 離心5min。
（6）棄上清，加Hanks液，1500rpm 離心10min，以去除血小板。
（7）棄上清（內(nèi)有血小板），加Hanks液混勻，加一滴凝血酶。
（8）轉(zhuǎn)動(dòng)Fisher離心管，促凝，至血小板凝塊產(chǎn)生（約2 min左右）。
（9）1500 rpm 離心10min，使血小板凝塊沉淀。
（10）取上層懸液轉(zhuǎn)至新Fisher管中，1500 rpm 離心10min。
（11）棄上清（去除凝血酶），加Hanks液重懸細(xì)胞，1500 rpm 離心15min，棄上清，重復(fù)此步驟1次。
（12）棄上清，用McCoy液懸起細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5~2´106/ml。
（13）如細(xì)胞懸液中還含有紅細(xì)胞，可加抗A、抗B、抗H處理，去除。
5.HLA血清板
（1）取干凈Terasaki塑料板，各孔中加入一定量石蠟油。
（2）用干凈微量注射器加1ml各種已知的對(duì)照血清和特異性抗血清于相應(yīng)各孔中。
（3）置-70℃或-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ū４嫫跒?~12個(gè)月）。
6.對(duì)照血清 陰性對(duì)照選用健康男性無輸血史的AB型血清，56℃30min滅活，或選用56℃30min滅活的健康人混合血清。陽性對(duì)照采用馬抗人淋巴細(xì)胞。
7.特異性抗體 采用經(jīng)產(chǎn)婦血清、多次受血者的血清、計(jì)劃免疫志愿者的血清、腎移植排斥者的血清或單克隆抗體。
【方法】
1.自-80℃冰箱中取出HLA血清板，在室溫下融化。
2.標(biāo)記血清板，標(biāo)明待檢細(xì)胞號(hào)碼。
3.將待檢的T淋巴細(xì)胞或總的外周淋巴細(xì)胞充分混合（1.5´106~2´106/ml）。
4.用軟滴法加1ml細(xì)胞懸液于各孔中，并使之與血清充分混合（用火花真空檢測(cè)器混勻），室溫（25℃）下30min。
5.每孔加兔補(bǔ)體5ml，室溫（25℃）下培養(yǎng)60min。
6.每孔加5ml伊紅染液，2 min后，加中性福爾馬林5ml于各孔中。
7.將50´75mm2玻片放在血清板上使各孔液滴扁平。置倒置顯微鏡下檢查細(xì)胞存活百分率。
【結(jié)果】
結(jié)果記錄以“6”或“8”為確切陽性反應(yīng)。細(xì)胞死亡則被染料著色，細(xì)胞呈灰暗色，體積增大，說明細(xì)胞表面有與特異的HLA抗體相對(duì)應(yīng)的抗原；如果淋巴細(xì)胞表面沒有與特異的HLA抗體對(duì)應(yīng)的抗原，則細(xì)胞不著色（著色細(xì)胞數(shù)<10%~19%）?；蚣?xì)胞具有折光性，大小正常。
<10%細(xì)胞死亡，記1分，為陰性
11%~19%細(xì)胞死亡，記2分，為陰性
20%~29%細(xì)胞死亡，記4分，為陽性可疑
30%~80%細(xì)胞死亡，記6分，為陽性反應(yīng)
>80%細(xì)胞死亡，記8分，為強(qiáng)陽性反應(yīng)
在陰性對(duì)照和陽性對(duì)照結(jié)果均正確的情況下，按“多數(shù)反應(yīng)原則”確定受檢細(xì)胞抗原。若結(jié)果異常，須仔細(xì)檢查每一步操作程序及試劑等是否符合要求，必要時(shí)重做。對(duì)于初學(xué)者，記4分的記錄，請(qǐng)有經(jīng)驗(yàn)者復(fù)查及判定結(jié)果，不要輕易下結(jié)論。
【討論】
1.注意事項(xiàng)
（1）此試驗(yàn)的關(guān)鍵在于獲得各種HLA標(biāo)準(zhǔn)抗血清，由于HLA抗體不是天然形成，不需經(jīng)同種異體抗原刺激產(chǎn)生。目前標(biāo)準(zhǔn)分型血清的主要來源是經(jīng)產(chǎn)婦和計(jì)劃免疫者。
（2）要注意淋巴細(xì)胞的存度與活性，因?yàn)榱＜?xì)胞和單核細(xì)胞能非特異性地吞噬染料而造成細(xì)胞損傷的假象；明顯的粒細(xì)胞和血小板沾染能引起假陰性反應(yīng)，因?yàn)樗鼈兣cHLA抗體結(jié)合，減少結(jié)合到淋巴細(xì)胞上的抗體；紅細(xì)胞沾染，在倒置顯微鏡下很難與小淋巴細(xì)胞鑒別。為此本試驗(yàn)用凝血酶等處理，盡量避免其他細(xì)胞（紅細(xì)胞、血小板、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞）沾染。
（3）若測(cè)定HLA-DR、DQ抗原時(shí)，除淋巴細(xì)胞改用B細(xì)胞、標(biāo)準(zhǔn)分型血清改用HLA-DR、DQ分型血清及抗B淋巴細(xì)胞作陽性對(duì)照外，操作步驟（4）、（5）試驗(yàn)條件分別改為37℃培養(yǎng)60min和25℃培養(yǎng)2h，其他與HLA-A、B、C抗原測(cè)定相同。
2.方法學(xué)評(píng)價(jià)
該法簡(jiǎn)單易行，抗血清用量和細(xì)胞用量均極少，結(jié)果可靠，重復(fù)性好，無需特殊儀器設(shè)備，故為上普遍采用的標(biāo)準(zhǔn)方法。
3.臨床意義
HLA分型在免疫遺傳學(xué)、人類學(xué)、器官移植、臨床輸血、親子鑒定及疾病相關(guān)研究等許多領(lǐng)域都有十分重要的意義和用途。例如在器官移植時(shí)，為了提高器官移植的成功率，必須盡量選擇比較理想的供者。除ABO血型抗原必須相容外，供者的HLA抗原盡可能與受者接近，尤其是 HLA-D、DR抗原具有更重要意義。
 

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