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士鋒生物神經(jīng)細胞培養(yǎng)大全

最近更新時間：2013-12-11

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體外神經(jīng)細胞的培養(yǎng)已成為神經(jīng)生物學研究中十分有用的技術手段。神經(jīng)細胞培養(yǎng)的主要優(yōu)點是:（1）分散培養(yǎng)的神經(jīng)細胞在體外生長成熟后,能保持結構和功能上的某些特點, 而且長期培養(yǎng)能形成髓鞘和建立突觸,這就提供了體內生長過程在體外重現(xiàn)的機會。（2）能在較長時間內直接觀察活細胞的生長、分化、形態(tài)和功能變化,便于使用各種不同的技術方法如相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、同位素標記、原位雜交、免疫組化和電生理等手段進行研究。（3）易于施行物理（如缺血、缺氧）、化學和生物因子（如神經(jīng)營養(yǎng)因子）等實驗條件, 觀察條件變更對神經(jīng)細胞的直接或間接作用。（4）便于從細胞和分子水平探討某些神經(jīng)疾病的發(fā)病機制，藥物或各種因素對胚胎或新生動物神經(jīng)細胞在生長、發(fā)育和分化等各方面的影響。 我們實驗室從80年代始開展了神經(jīng)細胞的體外培養(yǎng)工作，取得了一些經(jīng)驗，現(xiàn)將培養(yǎng)細胞分類及方法簡要介紹如下:

一、雞胚背根神經(jīng)節(jié)組織塊培養(yǎng)

主要用于神經(jīng)生長因子（NGF）等神經(jīng)營養(yǎng)因子的生物活性測定。在差倒置顯微鏡下觀察以神經(jīng)突起的生長長度和密度為指標半定量評估NGF的活性。

1、材料和方法

（1）選正常受精的雞蛋，置于37℃生化培養(yǎng)箱內孵化，每日翻動雞蛋一次。

（2）取孵化8-12 d 的雞蛋, 用70% 酒精消毒蛋殼，從氣室端敲開蛋殼，用消毒鑷剝除氣室部蛋殼。

（3）用彎鑷鉤住雞胚頸部，無菌條件下取出雞胚置小平皿內，除去頭部后，腹側向上置滅菌毛玻璃片上,用眼科彎鑷子打開胸腹腔，除去內臟器官。

（4）在解剖顯微鏡下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其兩側，在椎間孔旁可見到沿脊柱兩側排列的背根節(jié)（圖1），用一對5號微解剖鑷小心取出。

（5）置背根節(jié)于解剖溶液內，用微解剖鑷去除附帶組織，接種于涂有鼠尾膠的玻璃或塑料培養(yǎng)瓶中，在DMEM無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

2、結果

雞胚背根神經(jīng)節(jié)在含神經(jīng)生長因子（NGF, 2.5S，20ng/ml）的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h,神經(jīng)節(jié)長出密集的神經(jīng)突起。而未加NGF的神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)24 h, 未見神經(jīng)突起生長。

二、新生大鼠、新生小鼠及雞胚背根神經(jīng)節(jié)分散細胞培養(yǎng)

背根神經(jīng)節(jié)（DRG）細胞起源于神經(jīng)嵴，NGF研究Levi-Montalcini的實驗表明，外原性NGF能刺激DRG細胞生長發(fā)育并形成廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡。在體外，分離培養(yǎng)的神經(jīng)節(jié)在NGF存在的情況下，神經(jīng)突起的生長在一天之內可長達數(shù)毫米，因此，利用培養(yǎng)的DRG細胞，進行軸突生長發(fā)育的研究，是zui為經(jīng)典而常用的方法之一。

1、材料和方法

取新生一天的大鼠（wistar種）和小鼠（昆明種）。用眼科剪在無菌條件下除去背部皮膚, 然后剪取一段脊髓,背側朝上置于滅菌毛玻璃片上,在解剖顯微鏡下沿椎管兩側水平剪除腹側一半椎骨,暴露脊髓和神經(jīng)節(jié),用解剖鑷分離出神經(jīng)節(jié)。雞胚背根神經(jīng)節(jié)的取材方法同前。 剝除神經(jīng)節(jié)被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化（37℃ 30min）分散后用種植（Plating）培養(yǎng)液稀釋成0.2×105 個細胞/ml密度的細胞懸液，接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中,每皿2ml細胞懸液置。置標本于36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后傾去培養(yǎng)皿內種植培養(yǎng)液，改用飼養(yǎng)（Feeding）培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種第3d, 在培養(yǎng)皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神經(jīng)細胞的增殖, 作用48 h后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液，以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。

2、培養(yǎng)液成份

種植培養(yǎng)液: 80%Eagle's DMEM（含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L）;10%胎牛血清; 10%馬血清;NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。脫氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。

飼養(yǎng)培養(yǎng)液: 95%Eagle's DMEM（含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,）;5 % 馬血清; NGF 20ng/ml;神經(jīng)營養(yǎng)素 1ml/100ml;谷氨酰胺100μg/ml。

3、新生大鼠背根節(jié)神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征

新生大鼠背根節(jié)神經(jīng)元接種后4h,大部分細胞可貼壁, 呈圓形或橢圓形,直徑8-14μm, 胞體周圍呈現(xiàn)一圈光暈。神經(jīng)元的細胞核位于中央或偏于胞體一側,核仁明顯,亦可見雙核神經(jīng)元。接種后24h, 大部分貼壁細胞開始長出突起。其中多數(shù)為具有多個突起的多極神經(jīng)元,少數(shù)為雙極和假單極神經(jīng)元, 突起細長,并可觀察到突起末端的生長錐。除單個散布的神經(jīng)元外,還常見到幾個或多個神經(jīng)元聚集在一起, 它們向四周發(fā)出樹枝狀的神經(jīng)突起。 培養(yǎng)2-3d后神經(jīng)元的突起逐漸增多并延長, 形成稀疏的神經(jīng)網(wǎng)絡。隨著培養(yǎng)時間的延長, 神經(jīng)元突起的主干和分枝明顯延長并增粗,神經(jīng)突起網(wǎng)絡變得更加稠密, 神經(jīng)元胞體逐漸增大。大鼠背根節(jié)神經(jīng)元可維持培養(yǎng)2個月。

4、新生小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征

新生小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的形態(tài)結構和生長分化基本上與新生大鼠相似,但小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的胞體較大鼠稍小。 神經(jīng)元亦隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增大。小鼠背根節(jié)神經(jīng)元亦可維持培養(yǎng)2個月。

5、雞胚背根節(jié)神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征

雞胚背根節(jié)神經(jīng)元的生長分化基本上亦與新生大鼠和小鼠相似。但雞胚背根節(jié)神經(jīng)元以假單極為多見。 與大鼠或小鼠背根節(jié)培養(yǎng)神經(jīng)元相比,神經(jīng)突起分枝較少。神經(jīng)元胞體稍小,神經(jīng)元亦隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增大。雞胚背根節(jié)神經(jīng)元亦可維持培養(yǎng)2個月。

三、新生小鼠頸上交感神經(jīng)元分散細胞培養(yǎng)

交感神經(jīng)系統(tǒng)在維持機體的正常功能和對環(huán)境的適應性反應中起著十分重要的作用。交感神經(jīng)細胞培養(yǎng)特別有助于神經(jīng)細胞發(fā)育和可塑性研究，利用體外培養(yǎng)系統(tǒng)可進行交感神經(jīng)細胞的發(fā)生、死亡、形態(tài)和生化發(fā)育、遞質表形的獲得，以及靶組織與傳入纖維的突觸形成的研究。此外，通過體外培養(yǎng)系統(tǒng)可獲得關于神經(jīng)營養(yǎng)因子、激素，細胞因子等調節(jié)交感神經(jīng)元發(fā)育的信息，了解傳入纖維的輸入以及與靶組織的的機制。

1、材料和方法

實驗用出生當天的昆明種小鼠，在無菌條件下腹部朝上固定于塑料泡沫板上,用微解剖鑷在解剖顯微鏡下找到氣管兩側的頸總動脈,并以此為標志,在頸總動脈分為頸內外動脈交叉處找到上頸交感節(jié), 取出上頸交感節(jié), 置于含 1 % 膠元酶（Collagenase）和1 % 消化酶（Dispase）的2ml混合消化液中消化（37℃， 1 h）分散后，用種植（Plating）培養(yǎng)液稀釋成0.2×105個細胞/ml密度的的細胞懸液;接種于涂有小牛皮膠或以小鼠腦皮層膠質細胞為背景的35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿2ml細胞懸液置。置標本于36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后傾去培養(yǎng)皿內種植培養(yǎng)液,改用飼養(yǎng)（Feeding）培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種第3d, 在培養(yǎng)皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml, 作用48 h后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液,以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。

2、培養(yǎng)液成份

種植培養(yǎng)液: 80%Eagle's DMEM（含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L）;10%胎牛血清;10%馬血清;NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。脫氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。

飼養(yǎng)培養(yǎng)液: 95%Eagle's DMEM（含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,）;5%馬血清; NGF 20 ng/ml;神經(jīng)營養(yǎng)素 1ml/100ml;谷氨酰胺100μg/ml。

3、新生小鼠交感節(jié)神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征

新生小鼠交感節(jié)神經(jīng)元在含 NGF 的培養(yǎng)液中種植后4h, 細胞即開始貼附在膠元薄膜或在皮層膠質細胞層上生長, 交感神經(jīng)元的胞體一般為圓形, 有時亦可見橢圓或梭形,體積較大, 直徑約8-14μm左右,胞體周圍呈現(xiàn)一圈光暈,神經(jīng)元的細胞核大多偏于胞體一側,核仁明顯,亦可見雙核神經(jīng)元 。接種后24h, 大部分貼壁神經(jīng)元開始長出突起。培養(yǎng)2-3天后,神經(jīng)元突起逐漸增多并延長, 形成稀疏的網(wǎng)絡。隨著培養(yǎng)時間的延長, 神經(jīng)突起網(wǎng)絡變得更加稠密。神經(jīng)細胞的主干和分枝明顯延長并增粗, 神經(jīng)元的胞體逐漸增大。小鼠交感神經(jīng)元可維持培養(yǎng)1-2個月。

四、胚胎小鼠、大鼠、雞胚脊髓腹角運動神經(jīng)元培養(yǎng)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括腦和脊髓，脊髓是中樞的初級部分，其功能有二，一是傳導感覺和運動沖動，二是完成軀體運動的基本反射。脊髓突然被橫斷并與中級失去后產(chǎn)生脊休克。因此，利用體外培養(yǎng)的脊髓腹角運動神經(jīng)元進行脊髓損傷和修復的研究日益受到重視。

1、材料和方法

用12-14d 胚齡的小鼠、12-14d 胚齡的大鼠、 孵化10 d 的雞胚，在無菌條件下取出胎鼠或雞胚脊髓，剝除脊膜后,將整個脊髓腹側面朝上置于平皿中，用微解剖鑷和雙面刀片沿脊髓中央管縱切兩半，再將脊髓兩側的腹側部分切下，將組織塊切碎， 用0.125% 胰蛋白酶消化（37℃ 30min）分散后,用種植培養(yǎng)液（同第二節(jié)）稀釋成5×105個細胞/ml密度的細胞懸液,接種于涂有小牛皮膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中,每皿2ml,置36℃、10%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h后傾去培養(yǎng)皿內種植培養(yǎng)液, 改用飼養(yǎng)培養(yǎng)液（同第二節(jié)）進行培養(yǎng)。以后每周換液兩次,每次更換50%的新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。

2、胚胎小鼠、大鼠、雞胚脊髓腹角運動神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征

胚鼠和雞胚脊髓腹側神經(jīng)元培養(yǎng)12h后,大部分神經(jīng)元可貼壁,貼壁神經(jīng)元呈圓形,直徑5-8μm,其中少數(shù)神經(jīng)元開始伸出1-2個突起。培養(yǎng)24h后, 神經(jīng)元突起逐漸增多并延長,形成稀疏的網(wǎng)絡,培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元以雙極和多極為多見, 神經(jīng)元呈圓形或橢圓形及多邊形不等,胞核清楚,多數(shù)具1-2個核仁。隨著培養(yǎng)時間延長, 神經(jīng)元突起進一步增多、增粗并延長,形成稀疏的神經(jīng)網(wǎng)絡, 神經(jīng)元胞體逐漸增大。 多極胞體大的神經(jīng)元逐漸增多,經(jīng)膽堿乙酰轉移酶（ChAT）免疫組織化學染色和乙酰膽堿酯酶（AChE）組化染色呈陽性反應。此后，只要定期換液并適當抑制非神經(jīng)細胞的過度增殖,胚眙大鼠、胚盼小鼠和雞胚脊髓腹側運動神經(jīng)元在體外可維持培養(yǎng)2個月。

五、新生大鼠海馬神經(jīng)元分散培養(yǎng)

海馬屬大腦邊緣系統(tǒng)，與情緒、學習及記憶有關，它具有明顯的長突觸傳遞的長時間程長時程增強（LTP）和長時程抑制（LDT）的能力。LTP和LDP具有協(xié)動性、特異性、長時性的特點，目前已被認為是學習和記憶的基礎。而且海馬組織常常是引起癲癇發(fā)作的病變部位，并且海馬細胞對缺血、缺氧特別敏感。這些特征反映了海馬神經(jīng)元的內在性。例如，對缺氧的可塑性和易感性均與NMDA（N-methyi-D-aspartate，N-甲基-D-天冬氨酸）受體的*性質相關。海馬具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的典型特性，有相對同源性的神經(jīng)元群體，據(jù)估計，海馬主要的細胞類型---錐體神經(jīng)元占海馬全部神經(jīng)元的85%-90%。海馬CA1和CA2區(qū)含有的錐體細胞在電生理特性及其相互連接的形式上各不相同，并能分別進行培養(yǎng)。海馬錐體細胞具有特征性的形態(tài)，它們有單根軸突和數(shù)根樹突組成，所有的樹突都高度分化并密布樹突嵴。此外，海馬錐體神經(jīng)元相互之間與中間神經(jīng)元群體之間均有直接，在體外培養(yǎng)系統(tǒng)缺乏外源性傳入纖維的情況下，海馬神經(jīng)元相互間仍然能產(chǎn)生廣泛的突觸。

1、材料和方法

取當天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側海馬，用0.125%胰蛋白酶消化（36℃、30min）分散后,用種植培養(yǎng)液（同第二節(jié)）稀釋成5×105個細胞/ml密度的細胞液, 接種于涂有小牛皮膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中,每皿2ml,置標本于36℃,含10%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。24 h后頃去培養(yǎng)皿內種植培養(yǎng)液,改用飼養(yǎng)培養(yǎng)液（同第二節(jié)）培養(yǎng)。接種第5 d,在培養(yǎng)皿中分別加入細胞分裂抑制劑5'-氟- 2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml或加入阿糖胞苷 3μg/ml以抑制非神經(jīng)細胞的過度增殖, 作用48h 后更換新鮮培養(yǎng)液,以后每周換液2次,每次更換50%新鮮培養(yǎng)液。

2、新生大鼠海馬神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征

新生大鼠海馬神經(jīng)元種植后12h,大部分細胞可貼壁,呈圓形, 其中少數(shù)神經(jīng)細胞開始伸出1-2個突起。培養(yǎng)24h后,伸出突起的神經(jīng)細胞逐漸增多, 突起一般為20-40μm,長者可達60μm。培養(yǎng)3d后, 神經(jīng)元突起進一步增多并延長,形成稀疏的網(wǎng)絡。培養(yǎng)的海馬細胞以錐體細胞為多見,胞體較大,直徑6-12μm。隨著培養(yǎng)時間的延長,神經(jīng)元胞體逐漸增大,胞突主干和分技明顯延長并增粗,形成更加稠密的網(wǎng)絡。海馬神經(jīng)元在體外可維持培養(yǎng)2個月。

六、新生大鼠隔神經(jīng)元分散培養(yǎng)

隔亦屬大腦邊緣系統(tǒng)，主要與一系例內臟活動、軀體活動，情緒活動有密切關系。

1、材料和方法

取當天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側隔區(qū)，培養(yǎng)方法同海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。

2、新生大鼠隔神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征

新生大鼠隔區(qū)培養(yǎng)神經(jīng)元的生長分化基本上與新生大鼠海馬神經(jīng)元相似。但隔神經(jīng)元大多為具有兩個突起的雙極神經(jīng)元,神經(jīng)元胞體呈橢圓形, 直徑6-8μm。隨著培養(yǎng)時間的延長,神經(jīng)元胞體逐漸增大,神經(jīng)突起逐漸增粗, 并互相聯(lián)絡成網(wǎng)。新生大鼠隔神經(jīng)元亦可持續(xù)培養(yǎng)2個月。

七、新生大鼠下丘腦神經(jīng)元分散培養(yǎng)

下丘腦，作為神經(jīng)系統(tǒng)和內分泌系統(tǒng)的連接點，在神經(jīng)內分泌研究中有很重要的地位。它不僅通過神經(jīng)-神經(jīng)，神經(jīng)—體液通路與垂體發(fā)生直接的，以興奮與抑制兩種不同的機制維持垂體內分泌的相對恒定，而且與腦干網(wǎng)狀結構、皮質邊緣系統(tǒng)等共同調節(jié)機體的各種活動。下丘腦的分泌功能以及其所分泌的各種肽類激素、神經(jīng)多肽是下丘腦參與調節(jié)內臟活動、生理機能以及垂體內分泌的重要物質基礎。

1、材料和方法

取當天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側下丘腦，培養(yǎng)方法同海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。

2、新生大鼠下丘腦神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征

新生大鼠下丘腦神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征基本上和新生大鼠隔神經(jīng)元相似。培養(yǎng)的下丘腦神經(jīng)元大多為具有兩個突起的雙極神經(jīng)元,神經(jīng)元胞體呈橢圓形,直徑6-8μm,偶見胞體較大（直徑9-12μm）的多極神經(jīng)細胞。隨著培養(yǎng)時間的延長, 下丘腦神經(jīng)元胞體逐漸增大。下丘腦神經(jīng)元亦可維持培養(yǎng)2個月。

八、新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元分散培養(yǎng)

大腦皮質是大腦半球zui外表的一層灰質，大腦皮質內神經(jīng)元的數(shù)量極大，其類型也很多，但均屬多極神經(jīng)元，神經(jīng)元之間具有復雜的，反映皮質的高度發(fā)展。有人從機能上將皮質分為：感覺皮質、聯(lián)絡皮質、運動皮質。

1、材料和方法

取當天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側皮層，培養(yǎng)方法同海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。

2、新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征

新生大鼠皮層元的生長分化和形態(tài)特征基本上和新生大鼠海馬神經(jīng)元相似。培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中既可見到體積較大（直徑8-12μm）的錐體細胞和顆粒細胞（如星狀細胞、籃狀細胞和梭形細胞）,也可見到馬提諾蒂細胞,胞體較小,呈三角形或多角形。隨著培養(yǎng)時間的延長, 神經(jīng)元胞體逐漸增大,突起增粗。新生大鼠皮層神經(jīng)元亦可持續(xù)培養(yǎng)2個月。

九、新生大鼠紋狀體神經(jīng)元培養(yǎng)

位于大腦皮質下，緊靠丘腦背外側的幾塊灰質，稱為基底神經(jīng)節(jié)，它們包括尾狀核、殼核和蒼白球，前兩者合起來又稱為紋狀體。紋狀體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部位，在這里進行著運動機能的zui整合，它們與隨意運動的穩(wěn)定、肌緊張和軀體運動的整合有密切關系。中腦黑質除含有較多的多巴胺（DA）神經(jīng)元外，還含有γ-氨基丁酸（GABA）神經(jīng)元等，紋狀體是其主要的靶組織，共同組成黑質紋狀體DA系統(tǒng)。

十、新生大鼠中腦黑質神經(jīng)元培養(yǎng)

黑質由中腦背側的致密部和腹側的網(wǎng)狀部組成，中腦黑質是多巴胺神經(jīng)元存在的部位，實驗表明，大鼠中腦腹側多巴胺在運動和行為中起著關鍵性的作用。黑質多巴胺能神經(jīng)元退性病變可引起帕金森綜合癥。因此，多巴胺神經(jīng)元的體外培養(yǎng)為多巴胺神經(jīng)元的形態(tài)、受體分布、藥物作用、電生理特性的研究以及多巴胺神經(jīng)元移植研究提供了較好的實驗手段。

1、材料和方法

取當天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側黑質，培養(yǎng)方法同海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。

2、新生大鼠中腦黑質神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征

新生大鼠中腦黑質神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征基本上和新生大鼠下丘腦神經(jīng)元相似。培養(yǎng)的中腦黑質神經(jīng)元大多為具有兩個突起的雙極神經(jīng)元,神經(jīng)元胞體呈橢圓形,直徑6-8μm，隨著培養(yǎng)時間的延長, 中腦黑質神經(jīng)元胞體逐漸增大。中腦黑質神經(jīng)元亦可維持培養(yǎng)2個月。

十一、新生大鼠小腦神經(jīng)神經(jīng)元培養(yǎng)

小腦由外層的灰質（皮質）、內部的白質和三對深部的核團（頂核、間位核和齒狀核）組成。與大腦皮質相比，小腦皮質的結構和神經(jīng)元環(huán)路的組成相對簡單，整個小腦皮質共有三層結構：分子層、浦肯野細胞層和顆粒層。其中含有五種神經(jīng)元，即顆粒細胞，浦肯野細胞、籃狀細胞、星形細胞和高爾基細胞。小腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中zui大的運動機構，主要作用是維持軀體平衡，調節(jié)肌肉張力和協(xié)調隨意運動。小腦的另一個與運動有關的重要功能是在技巧性運動的獲得和建立過程中發(fā)揮運動學習的作用。在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，小腦細胞大小和形態(tài)的特征明顯，容易識別。另外，小腦缺陷神經(jīng)突變的小鼠種系比較多，這些條件都使小腦細胞成為發(fā)育研究的良好對象。

1、材料和方法

取當天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側小腦，培養(yǎng)方法同海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。

2、新生大鼠小腦神經(jīng)細胞的生長分化和形態(tài)特征

新生大鼠小腦神經(jīng)元的生長分化基本和新生大鼠皮層神經(jīng)元相似。培養(yǎng)的小腦神經(jīng)元以顆粒細胞為多見,體積較小,直徑3-5μm,亦可見到一定數(shù)量的星狀細胞,哺肯野細胞和籃狀細胞（胞體直徑6-8μm）,它們均隨著培養(yǎng)時間的延長,神經(jīng)元胞體逐漸增大,突起逐漸增粗。新生大鼠小腦神經(jīng)元亦可持續(xù)培養(yǎng)2個月。

十二、新生大鼠腦腺垂體細胞培養(yǎng)

大鼠的垂體分為前、中、后三葉，前葉亦稱腺垂體，主要分泌生長激素、催乳素、各種促激素及黑素細胞刺激素。因此建立體外培養(yǎng)腺垂體細胞的方法，可用來探討各種因素直接對細胞分泌功能的影響，以及開展神經(jīng)內分泌分子生物學的研究。

1、材料和方法

取當天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下分離出腺垂體，用0.125%胰蛋白酶消化（36℃、30min）分散后,用種植培養(yǎng)液（同第二節(jié)）稀釋成2×106個細胞/ml密度的細胞液, 接種于涂有小牛皮膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中,每皿2ml,置標本于36℃,含10%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。24 h后頃去培養(yǎng)皿內種植培養(yǎng)液,改用飼養(yǎng)培養(yǎng)液（同第二節(jié)）培養(yǎng)。以后每周換液2次,每次更換50%新鮮培養(yǎng)液。

2、新生大鼠腦腺垂體細胞的生長形態(tài)特征

接種后24h,新生大鼠腦腺垂體分散細胞即開始貼附在膠元薄膜上生長,腦腺垂體細胞zui初分散或聚集成小團,隨后迅速分裂增殖。細胞境界清楚, 形狀不規(guī)則,有圓形,卵圓或多角形。核位于胞體中央或偏于胞體一側,可見1-2個核仁。隨著培養(yǎng)時間的延長,腦腺垂體細胞胞體逐漸增大,形成單層, 鋪滿皿壁底層。腦腺垂體細胞可持續(xù)培養(yǎng)1個月。

十三、神經(jīng)膠質細胞培養(yǎng)

（一）雪旺細胞

雪旺細胞（Schwann cell，SC）是外周神經(jīng)系統(tǒng)zui主要的膠質細胞，也是外周神經(jīng)的成髓鞘細胞;它形成髓鞘，或包裹軸突而不形成髓鞘。雪旺細胞的功能極其活躍，一旦神經(jīng)受損，它能反應性分裂增殖，分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，產(chǎn)生細胞外基質和細胞粘附分子，對神經(jīng)元及其軸突起營養(yǎng)和修復作用。近年來的研究表明，雪旺細胞也能促進中樞神經(jīng)對脫髓鞘損傷的修復，如對脊髓的再生，對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)以及對隔-海馬通路再生等。說明雪旺細胞也能改善中樞神經(jīng)再生的微環(huán)境，因而近年來對雪旺細胞的研究，尤其是體外培養(yǎng)研究已成熱點。

1、材料和方法

雪旺細胞培養(yǎng)取材于各類哺乳動物的外周神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)，取孵化8-12d雞胚、出生1-3d 的小鼠或大鼠和人工流產(chǎn)的人胎兒，在無菌條件下用解剖鑷分離出神經(jīng)節(jié)，剝除神經(jīng)節(jié)被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化（37℃ 30min）后用培養(yǎng)液（ 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成細胞懸液，先接種于玻璃培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中孵育30 min后，翻轉瓶子吸出細胞懸液，除去已貼壁的成纖維細胞，再接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中, 種植密度為0.2×105 個細胞/ml，每皿2ml細胞懸液置。置36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種第3 d, 在培養(yǎng)皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml，以進一步去除成纖維細胞, 作用48小時后更換新鮮培養(yǎng)液，以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。

2、雪旺細胞的生長和形態(tài)特征

培養(yǎng)15d后可獲得較高純度的雪旺細胞，雪旺細胞呈雙極梭狀，核卵居中，相互平行排列，經(jīng)S-100免疫組織化學染色呈陽性反應。增殖分裂的雪旺細胞可用于進一步傳代培養(yǎng)，也可進行冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

（二）星形膠質細胞

星形膠質細胞是膠質細胞中體積zui大，數(shù)量zui多的一種，胞體呈星形，核大，呈卵圓形，染色質，星形膠質細胞分兩類，一類為原漿性星形膠質細胞（protoplasmic astrocyte），其突起短粗，分枝多。另一種為纖維性星形膠質細胞（fibrous astrocyte），它的突起細長，分枝少。纖維性星形膠質細胞是與少突膠質細胞源自同一前體細胞。星形膠質細胞具有多種功能，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內神經(jīng)元及其突起間的空隙幾乎全部由星形膠質細胞充填，起結構的支持作用，星形膠質細胞的突起構成血腦屏障，星形膠質細胞能攝取和代謝某些神經(jīng)遞質如γ-氨基丁酸等。調節(jié)局部神經(jīng)遞質的濃度，使神經(jīng)網(wǎng)絡能平穩(wěn)地發(fā)揮作用。還能吸收細胞間隙中過多的K+，為K+的存儲庫，通過調節(jié)K+的水平而影響神經(jīng)元的電生理活動。星形膠質細胞能合成和分泌大量神經(jīng)營養(yǎng)因子，有維持神經(jīng)元生存和促進神經(jīng)元突起生長的作用，亦能分泌白細胞介素，腫瘤壞死因子和干擾素等多種細胞因子，星形膠質細胞有分裂能力，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，星形膠質細胞增生、肥大，填補缺損，形成膠質瘢痕。

（1）方法和結果

選擇出生 2 d 的SD大鼠，無菌條件下分離出大腦皮層，用0.125%胰蛋白酶消化（37℃ 30min）后用培養(yǎng)液（ 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成細胞懸液，先接種于玻璃培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中孵育30 min后，翻轉瓶子吸出細胞懸液，除去已貼壁的成纖維細胞，再接種于涂有鼠尾膠的75cm2塑料培養(yǎng)瓶中, 種植密度為1×105 個細胞/cm2，每瓶10ml細胞懸液置。置36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液2 次，培養(yǎng)10-14h，細胞分為兩層，下一層為I型膠質細胞即原漿形膠質細胞，上一層是O-2A前體細胞，根據(jù)兩類細胞貼壁能力的差異，以振蕩培養(yǎng)技術進行分選，在37℃搖床上振蕩，16 h（180r/min）O-2A前體細胞可被搖下來，搖下來的細胞種植在涂有鼠尾膠的75mcm2塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液使用20 % 胎牛血清促進O-2A前體細胞分化為II型膠質細胞即纖維型膠質細胞?？煞至言鲋车脑瓭{形膠質細胞和纖維型膠質細胞可用于進一步傳代培養(yǎng)，也可進行冷凍保存?zhèn)溆?。純度鑒定可用膠質纖維酸性蛋白抗體（GFAP）染色確定。

（三）少突膠質細胞

1、方法和結果

少突膠質細胞培養(yǎng)方法同星形膠質細胞培養(yǎng)。少突膠質細胞比星形膠質細胞小，光鏡下少突膠質細胞胞體呈圓形或多角形，突起呈串珠狀，根據(jù)其所在部位的不同可分為束間少突膠質細胞、神經(jīng)元周圍少突膠質細胞。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內，少突膠質細胞主要形成及維持髓鞘。

討論

在神經(jīng)生理、生化和神經(jīng)藥理的研究中、神經(jīng)細胞的體外培養(yǎng)日益受到重視,因為它是研究單個神經(jīng)細胞功能和結構的適宜方法。在體外培養(yǎng)條件下背根神經(jīng)節(jié)、頸上交感節(jié)、胚胎脊髓和不同腦區(qū) （海馬、隔、下丘腦、大腦皮層、小腦和垂體細胞等）培養(yǎng)細胞的形態(tài)特征都不盡相同，這與它們具有不同功能有關。交感和感覺神經(jīng)元以及不同腦區(qū)神經(jīng)元的體外培養(yǎng)成功, 為我們深入研究它們的結構和功能提供了合適的體外實驗模型。在背根節(jié)神經(jīng)細胞培養(yǎng)過程中, 我們觀察到, 早期感覺神經(jīng)元發(fā)育階段,NGF是*的營養(yǎng)因子,但在培養(yǎng)后期,神經(jīng)元已發(fā)育成熟, 可能非神經(jīng)細胞分泌的極少量NGF即能滿足神經(jīng)元生長需要,因此不另NGF也能維持長期培養(yǎng)。在上頸交感節(jié)細胞分散培養(yǎng)過程中, 我們亦觀察到,若zui初1-2d在培養(yǎng)液中缺乏 NGF,交感神經(jīng)元突起不見生長,且大多死亡。培養(yǎng)15d或1個月時,如果培養(yǎng)液中未加入NGF, 本來生長良好的神經(jīng)元很快便出現(xiàn)顆粒變性或空泡, 逐漸死亡。結果表明NGF對于促進神經(jīng)突起生長和維持神經(jīng)元生存有顯著作用。在神經(jīng)細胞培養(yǎng)過程中,神經(jīng)細胞的生長發(fā)育受到多種因素的影響,其中細胞接種密度對細胞生長發(fā)育影響較大,一般神經(jīng)細胞的接種密度以0.5-1×106 個細胞/ml密度為宜,如每毫升中超過3×106個細胞/ml密度 ,將使細胞簇過大,而且培養(yǎng)皿內過分擁擠, 影響存活和生長。但如果培養(yǎng)的細胞數(shù)目過少時,神經(jīng)細胞的生長分化較差,因為神經(jīng)細胞是一種細胞群體, 它們相互之間具有營養(yǎng)和支持作用。其次是控制非神經(jīng)元細胞過多增殖。原代分散單層培養(yǎng)是神經(jīng)細胞與非神經(jīng)細胞的混合培養(yǎng)。其中膠質細胞等可在體外繼續(xù)增殖, 神經(jīng)元則不能增殖而只能生長分化。當適量膠質細胞的存在是神經(jīng)細胞長期培養(yǎng)的必要條件,但如果神經(jīng)膠質細胞過渡增殖時，神經(jīng)細胞的生長分化便受到一定影響, 常使神經(jīng)細胞提早開始退化。這可能是由神經(jīng)膠質細胞頻繁分裂過程中, 奪取了神經(jīng)細胞生長中需要的某種營養(yǎng)成份。為保證神經(jīng)元生長所需的營養(yǎng), 需在非神經(jīng)細胞增殖的高峰即所謂“合流”（confluence）時,將一定量的抗DNA 藥物加入培養(yǎng)液中以抑制其過渡增殖,實驗證明,在培養(yǎng)第5d 或第7d時使用 5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml或阿糖胞苷3μg/ml,作用48h即停用可加快神經(jīng)元的分化, 延長培養(yǎng)時間。再次是所配制的培養(yǎng)液必須保持一定的等滲性, 溶解于培養(yǎng)基的物質濃度所產(chǎn)生的等滲性必須與細胞外液的液體一致,培養(yǎng)神經(jīng)細胞可將培養(yǎng)液的滲透壓調節(jié)到320-330 mOso 較為合適。如果培養(yǎng)液是高滲的,細胞會失去水份并發(fā)生皺縮, 如果培養(yǎng)液是低滲的, 細胞會吸收水分而膨脹。兩者不利于神經(jīng)細胞的存活和生長。 zui后需注意的是須掌握換液的次數(shù)和數(shù)量。為了使神經(jīng)細胞得到生長分化必須的營養(yǎng),必須經(jīng)常進行換液,但如果換液次數(shù)太多,并不利于神經(jīng)細胞的生長分化,因為神經(jīng)細胞在培養(yǎng)液中需要適當?shù)沫h(huán)境,而且它本身也有創(chuàng)造良好環(huán)境的能力, 如果頻繁換液就會破環(huán)這種環(huán)境。我們每周換液二次,每次只換一半, 保留一半原液。除此之外,培養(yǎng)液的PH、溫度等均對神經(jīng)元的生長發(fā)育有影響,因而在實驗中必須加以注意。
 

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