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士鋒生物基因免疫技術(shù)介紹
最近更新時間：2014-1-3
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一、 概 述
(一) 基因免疫的概念
基因免疫(gene immunization)又稱DNA免疫或核酸免疫，是指將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA) 與質(zhì)粒重組后,利用某種方法直接導(dǎo)入動物細(xì)胞內(nèi),使帶有目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到體內(nèi),通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白,誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生針對該抗原蛋白的抗體并引起特異的免疫應(yīng)答以達(dá)到預(yù)防和治療的目的,因此也將這種免疫制劑稱為基因疫苗(gene vaccine)或核酸疫苗(nucleic acid vaccine)。
(二) 基因免疫的特點和優(yōu)點
1. 基因免疫可根據(jù)需要選擇目的基因,該基因可以是完整的一組基因或單個基因的DNA,也可以是編碼抗原決定簇的一段核酸序列,其表達(dá)產(chǎn)物是病原體的有效成分,可引發(fā)保護(hù)性免疫,這就避免了毒力回升的危險。
2. 基因免疫時產(chǎn)生的抗原多肽,其遞呈過程和自然感染時相似,以其抗原天然構(gòu)象遞呈給免疫系統(tǒng),對于構(gòu)象型抗原表位引發(fā)的保護(hù)性免疫尤為重要。而以重組技術(shù)合成的蛋白抗原常造成構(gòu)象型抗原表位的改變或丟失。
3. 基因疫苗具有相同的理化性質(zhì),為聯(lián)合免疫提供了可能。選擇編碼病毒保守蛋白的基因序列制備疫苗,可使機體獲得對異源株的保護(hù)性免疫。此外，因質(zhì)粒dna可長期在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，強化B細(xì)胞和T細(xì)胞記憶效應(yīng)，從而使機體獲得持續(xù)的保護(hù)性免疫。
4. 含不同抗原基因的多種質(zhì)粒可混合使用，它們之間沒有干擾，可同時預(yù)防多種疾病。
5. 基因疫苗作為一種重組質(zhì)?？梢栽诠こ叹写罅繑U增，其生產(chǎn)比傳統(tǒng)的滅活苗、弱毒苗、亞單位苗等要簡單，成本要低。
6. DNA疫苗在常溫下非常穩(wěn)定，有利于儲藏運輸，且接種法簡便。
二、輪狀病毒VP7基因的基因免疫
（一）材料與方法
1. 質(zhì)粒與細(xì)菌 真核載體pCX-EGFP和含有輪狀病毒VP7基因的pCX-EGFP-VP7。質(zhì)粒的制備、DNA重組均參考分子克隆。菌株E.coli DH為質(zhì)粒的宿主菌。
2. 酶與試劑 限制性內(nèi)切酶、連接酶、牛小腸堿性酶(CIP)、DNA純化試劑盒。
3. 細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 將真核細(xì)胞的重組表達(dá)質(zhì)粒pCX-EGFP-VP7的DNA用電擊轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，48小時后收獲細(xì)胞及細(xì)胞上清。
4. DNA的制備及小鼠的免疫 質(zhì)粒載體pCX-EGFP-VP7經(jīng)酶切鑒定的大量提取DNA，經(jīng)純化，作為免疫用DNA。Balb/C小鼠免疫。每只鼠的四頭肌注射鹽酸普魯卡因，約20分鐘后分組在相同部位肌肉注射約100ug純化的pCX-EGFP-VP7或pCX-EGFP。2周后,將每組實驗鼠分成兩部分,一部分按以上方法再次接種同量的DNA，另一部分不再接種，作為對照繼續(xù)飼養(yǎng)。
5. 免疫小鼠抗體水平的測定 將免疫的小鼠編號，分為載體質(zhì)粒及重組表達(dá)質(zhì)粒的再次和初次免疫，每隔2周眼球取血一次，共取5次，保存血清。用ELISA方法檢測抗體產(chǎn)生情況。觀察抗體水平動態(tài)變化。
6．表達(dá)pCX-EGFP-VP7的質(zhì)粒DNA與基因工程CHO細(xì)胞表達(dá)的抗原蛋白免疫原性的比較。
（二）、CHO細(xì)胞表達(dá)VP7的免疫原性測定
1．經(jīng)腹腔注射免疫6只4周齡的Balb/C小鼠，大約0.5ml(60ug)VP7抗原與等量佐劑混合用，每間隔14天再免疫兩次，于末次免疫第4、6周取鼠血，測定抗體。
2．免疫熒光法檢測抗體 用B95-8細(xì)胞涂片，分別取用DNA和抗原蛋白免疫小鼠4、6周后的血清，待檢血清從1:10開始倍比稀釋至1:160，用抗輪狀病毒的單克隆抗體作為陽性對照，分別用熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體孵育后，用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。