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士鋒生物常用的標(biāo)記免疫酶及其底物詳細(xì)介紹
最近更新時(shí)間：2014-1-13
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1.標(biāo)記酶的選擇條件
⑴ 活性高，分解底物的能力強(qiáng)。
⑵ 特異性強(qiáng)，即作用于底物的專(zhuān)一性強(qiáng)。
⑶ 與抗原抗體結(jié)合后仍保持酶的活性。
⑷ 與底物作用可以顯色。
⑸ 純度高、易純化，即含雜蛋白少。
⑹ 可溶性(水溶性)好，在溶液中穩(wěn)定。
⑺ 測(cè)定方法簡(jiǎn)單。
⑻ 酶來(lái)源方便、價(jià)格低廉。
2.符合條件的酶
⑴ 辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP)，分子量40 000。
⑵ 堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase AKP)，分子量82 000。
⑶ β-半乳糖甙酶(β-galactosidase)，分子量540 000。
⑷ 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase),分子量186 000。
其中以HRPzui為常用，因其具有活力高、穩(wěn)定、分子量小、易提純等優(yōu)點(diǎn)。
3.辣根過(guò)氧化物酶
HRP廣泛地分布于植物界，以辣根中含量zui高。它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉輔基組成的一種糖蛋白，含糖量18%，它由300個(gè)氨基酸和4個(gè)二硫鍵連接而成。分子量40 000，等電點(diǎn)5.5～9.0之間，它催化的zui適pH因供氫體不同而有所差異，但多在pH5.0左右。HRP易溶于水和58%以下的飽和硫酸銨溶液。
HRP酶蛋白和其它雜蛋白的zui大吸收光譜為275nm，輔基部分的zui大吸收光譜為403nm，二者比值OD403/OD275為酶的純度。以RZ值(Reinheit Zabl德文)表示。RZ>3為高質(zhì)量，RZ>2.5為中等質(zhì)量，RZ<2.5則需要純化。RZ值越小，表示雜蛋白越多,如RZ為0.6，則表示有75%的雜蛋白。
衡量酶質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)有兩條，一個(gè)是純度即RZ值，一個(gè)是活力。只用酶的純度表示是不全面的。目前上規(guī)定,酶的活力以單位表示。一個(gè)酶單位是在一定的條件下(pH、溫度和底物濃度)一分鐘能降解1mMol/L底物的酶活力。1mg酶所含有酶的單位數(shù)稱(chēng)為比活性。用比活性進(jìn)行酶的比較。
用作標(biāo)記的過(guò)氧化物酶活性一般要大于250units/mg。
4.HRP的作用底物與供氫體 底物為H2O2，催化時(shí)需供氫體。
⑴ 組化法常用的供氫體是3，3′-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(3.3-diamino-benzidine . DAB)。其反應(yīng)物由于形成的氧化型中間體迅速聚合，形成不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用于光學(xué)顯微鏡觀察。這種多聚物能還原和螯合OSO4形成具有電子密度的產(chǎn)物，可適用于電子顯微鏡觀察。
⑵ 用于ELISA的供氫體有下列數(shù)種。
表 ELISA的供氫體
供 氫 體 反應(yīng)顏色 波長(zhǎng) 終止劑 終止
顏色 測(cè)定波長(zhǎng)
聯(lián)大茴香胺(OD) 桔紅 512 5Mol/L HCI 黃 400
鄰苯二胺(OPD) 黃 444 2Mol/L H2SO4 桔黃 492
鄰苯甲苯胺(OT) 蘭 636 2Mol/L H2SO4 黃 442
5－氨基水楊酸 褐 475 1Mol/L NaOH 褐 449
以O(shè)D和OPDzui為常用。OPD有致癌作用，使用時(shí)需注意。
5.堿性磷酸酶
可從小牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。它是一種磷酸脂酶,其作用是催化磷酸-脂水解釋放出無(wú)機(jī)磷酸而顯色?；蛘咄ㄟ^(guò)水解產(chǎn)生的磷酸與鉬酸反應(yīng)生成磷鉬酸，然后在還原劑作用下生成藍(lán)色的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。