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士鋒生物蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳 蛋白質(zhì)印跡免疫分析
最近更新時(shí)間：2014-1-16
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?一、蛋白質(zhì)sds-page電泳
1、安裝垂直板電泳裝置
用洗潔精、清水和無(wú)水乙醇清洗兩塊玻璃板，晾干后安裝。
2、制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠
(1)配制9%分離膠(15ml)：雙蒸水6.55ml，1.5M Tris-HCl(pH8.8)3.75ml，30%丙烯酰胺儲(chǔ)存液(Acry/Bis)4.5ml，10%SDS 150ml，10%過(guò)硫酸銨(APS)50ml，混勻后加入3.75ml TEMED，立即混勻，灌入裝好的垂直板中，至距離短玻璃頂端約2cm處。檢查是否有氣泡，如果有，用濾紙條吸出。在膠液上面加一層雙蒸水，靜置，待凝膠與水的界面清晰時(shí)，說(shuō)明分離膠已聚合(約30分鐘)，去除水相，用濾紙吸干殘存的液體。
(2)配制4%濃縮膠(10ml)：雙蒸水6.1ml，0.5M Tris-HCl(pH6.8)2.5ml，30%丙烯酰胺儲(chǔ)存液(Acry/Bis)1.3ml，10%SDS 100ml，10%過(guò)硫酸銨(APS)50ml，混勻后加入10ml TEMED，立即混勻，灌入垂直板中至短玻璃頂端，插入梳子，避免產(chǎn)生氣泡，靜置，約60分鐘后，膠聚合，拔去梳子，用電極緩沖液沖洗加樣孔，以去除未聚合的丙烯酰胺。
(3)將凝膠固定在電泳槽中，上下槽各加入1´Tris-甘氨酸電泳緩沖液，驅(qū)除兩玻璃板間凝膠底部的氣泡。
3、樣品處理及上樣
在Ependorf管中加入蛋白提取液16ml，5×上樣緩沖液4ml，充分混勻，與蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)一起放在100°C沸水中煮5分鐘后，用微量加樣器上樣。為了便于比較蛋白電泳結(jié)果和免疫印跡結(jié)果，采取對(duì)稱加樣。
4、電泳
將電泳裝置接通電源。開(kāi)始電泳時(shí)，電壓為80V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)到150V。繼續(xù)電泳至樣品前沿抵達(dá)分離膠底部，斷開(kāi)電源。
二、蛋白質(zhì)印跡免疫分析(Western Blot)
1、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜
(1)取下膠板，小心去除一側(cè)玻璃板，切去濃縮膠和分離膠無(wú)樣品的部分，將凝膠分成兩半，含分子量標(biāo)準(zhǔn)的部分用考馬斯亮藍(lán)染色。
(2)測(cè)量剩余膠的大小，按該尺寸剪取一張硝酸纖維素膜和兩張濾紙(BioRad)，在轉(zhuǎn)移緩沖液中將膜和濾紙浸泡15分鐘。
(3)海綿在轉(zhuǎn)移緩沖液中充分浸濕。
(4)用于轉(zhuǎn)膜的凝膠放在轉(zhuǎn)移緩沖液中洗滌。
(5)打開(kāi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移槽夾板，按下列順序依次安放：
a.浸濕的海綿
b.用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙
c.凝膠
d.硝酸纖維素膜
e.用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙
f.浸濕的海綿
在每放一層的時(shí)候，都要沖加轉(zhuǎn)移緩沖液，小心地趕走每層之間的氣泡。
(6)小心合上夾板，放入轉(zhuǎn)移槽中，倒入轉(zhuǎn)移緩沖液，加冰塊。
(7)插入電極，注意正負(fù)極的方向，將電泳儀調(diào)至150mA，轉(zhuǎn)移2小時(shí)。
2、封閉 ：將轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜放在TBS緩沖液中，漂洗5分鐘，然后膜的正面朝上，放在裝有封閉液的平皿中，室溫輕搖30分鐘。
3、一抗結(jié)合將硝酸纖維素膜放入雜交袋中，封好三面，按0.1ml/cm2加入封閉液和小鼠抗人p53蛋白的單克隆抗體(1:400稀釋)，驅(qū)趕氣泡，封嚴(yán)雜交袋，膜的正面朝上，放在搖床上，4°C輕搖。
4、二抗結(jié)合
剪開(kāi)雜交袋，取出硝酸纖維素膜，用TTBS漂洗3次，每次5分鐘。再將膜放入雜交袋，封好三面，按0.1ml/cm2加入封閉液和堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(1:500稀釋)，驅(qū)趕氣泡，封嚴(yán)雜交袋，膜的正面朝上，放在搖床上，室溫下輕搖2小時(shí)。
5、顯色反應(yīng)
取出膜，用TTBS漂洗3次，每次5分鐘。按BCIP:NBT:稀釋液=1:1:50的比例配制顯色液(其中，稀釋液在使用前，先用蒸餾水將濃縮的稀釋液一次性稀釋為工作液，密封4°C保存)，混勻后立即將顯色液和膜封入雜交袋中，置暗處反應(yīng)，待顯色反應(yīng)達(dá)到*程度時(shí)，取出膜，用蒸餾水漂洗終止反應(yīng)，晾干后封入塑料袋中保存。
6、照相保存結(jié)果進(jìn)行分析