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士鋒生物免疫組化雙抗染色實驗流程
最近更新時間：2014-1-22
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大小：50.6KB
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一、脫蠟和水化
方法同SP法。
二、*抗體的染色
1、將切片浸在3%H2O2甲醇溶液(新鮮配制)中10min，PBS沖洗3min×3次;
2、加100ul(2滴)血清封閉溶液(試劑1)到切片上，室溫孵育10min，倒掉(不能沖洗);
3、加入一抗(按照說明書推薦濃度和孵育條件);
4、使用含有0.05%吐溫20的PBS(TPBS)，沖洗5min×3次;
5、加入100ul(2滴)生物素化的二抗(試劑2)，室溫孵育10min;
6、用TPBS沖洗5min×3次;
7、加入100ul(2滴)鏈霉親和素-AP(試劑3)的二抗，室溫孵育10min;
8、用TPBS沖洗5min×3次;
9、準(zhǔn)備底物溶液：將1滴試劑4A和4B加入到1ml去離子水中，充分混勻。再加入1滴試劑4C，充分混勻;
10、加100ul(2滴)配好的AP底物溶液，室溫孵育(鏡下掌握孵育時間);
11、使用含有0.05%吐溫20的去離子水沖洗終止反應(yīng)。
三、第二抗體的染色
12、加100ul(2滴)雙染增強劑(試劑7)，孵育;
13、用TPBS沖洗3min×3次;
14、加100ul(2滴)血清封閉溶液(試劑1)到切片上，室溫孵育10min，倒掉(不能沖洗);
15、加入稀釋好的一抗(按照說明推薦濃度和孵育條件);
16、用TPBS沖洗5min×3次;
17、加入100ul(2滴)生物素化的二抗(試劑2)，室溫孵育10min;
18、用TPBS沖洗5 min×3次;
19、加入100ul(2滴)鏈霉親和素-HRP(試劑5)的二抗，室溫孵育10min;
20、用TPBS沖洗5min×3次;
21、 準(zhǔn)備底物溶液：將1滴試劑6A和6B加入到1ml去離子水中，充分混勻。再加入1滴試劑6C，充分混勻;
22、 加100ul(2滴)配好的HRP底物溶液，室溫孵育(鏡下掌握孵育時間);
23、 使用含有0.05%吐溫20的去離子水沖洗終止反應(yīng);
24、 使用復(fù)染試劑染色(根據(jù)需要選擇);
25、 封片劑(試劑8)封片，顯微鏡觀察并拍照。