QQ交談
您所在位置：請輸入產品關鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個性化：www.shifengsj.com
網址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://m.duoo135.com/st236594/
動物細胞培養(yǎng)中Hanks液、D-Hanks液和消化液的配制方法
最近更新時間：2014-2-24
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>50.6KB
文件類型：PNG 圖片下載次數(shù)：310次
資料類型：未知文件瀏覽次數(shù)：1155次
動物細胞培養(yǎng): hanks、D-Hanks液和消化液(胰酶液)的配制
實驗目的：熟練掌握Hanks、D-Hanks液等平衡鹽溶液的配制，了解消化液(胰酶液)的配制方法。
實驗原理：Hanks液是常見的平衡鹽溶液(BSS)之一。D-Hanks液則是無鈣鎂離子的Hanks液。BSS與細胞生長狀態(tài)下的pH值、滲透壓及無菌狀態(tài)一致，且配方簡單，是組織培養(yǎng)基本用液，常用于配制培養(yǎng)基及其他用液，或洗細胞等，細胞在BSS中可生存幾個小時。 胰蛋白酶(胰酸)溶液是一種常用的細胞消化液，原代培養(yǎng)時用于處理組織塊，使細胞分離下來。傳代時用胰蛋白酶使培養(yǎng)細胞離開所貼附的培養(yǎng)瓶表面，并分散成單個細胞。胰蛋白酶主要采自?；蜇i的胰臟，呈白色粉末狀，易潮解，應在低溫干燥處保存。胰酶的活力常用一份胰酶解離酪蛋白的份數(shù)表示，常用胰酶活力為1：125或1：250。本實驗室一般用1：250(GRC公司生產)。胰蛋白酶對細胞的分離效果與細胞的類型、特性和瓶壁表面特性有關。一般來說濃度大、溫度高(勿高于37℃)、作用時間長，則對細胞分離能力大。但超過一定程度會損傷細胞，導致細胞傳代后不能貼壁或死亡。胰酶在pH 8.0、37℃時消化能力zui強。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清會降低胰酶活力，所以配制胰酶時須用無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。當消化結束時，可加入少量血清或含血清的培養(yǎng)基以終止胰酶作用。 細胞傳代使用的胰酶濃度是0.25%或0.2%。用于原代細胞培養(yǎng)消化組織塊則為0.1%或0.125%。
實驗材料與用品
***材料：3 000 mL錐形瓶，25 mL、50 mL試劑瓶，500 mL輸液瓶，螺口蓋，翻帽塞，pH試紙，孔徑0.22μm的微孔濾膜。
***藥品：NaCl，Na2HP04，KH2P04，KCl，酚紅，NaHC03，胰蛋白酶干粉，0.02%EDTA，CaCl2，D-葡萄糖，MgCh·6H20，MgS04·7H20，酚紅(0.1%)(配法：稱酚紅2 g，置于研磨器中，先用數(shù)滴5.6%的NaHCO3溶液溶解并研磨，再加進該5.6%NaHC03溶液使zui終體積為100 mL。瓶裝保存，備用)。
***儀器(請參看儀器圖庫)： 抽濾泵1套，過濾器1套，高壓滅菌鍋，量筒，磁力攪拌器，研磨器。
實驗步驟
(一)配制D-Hanks液
1.按表2—3—5稱取D-Hanks試劑。
2.依次加入上述試劑至800 mL蒸餾水中，溶解后定容至1 1000 mL。 3.高壓滅菌，10磅10 min。
<img alt="動物細胞培養(yǎng)中Hanks液、D-Hanks液和消化液的配制方法" 動物細胞培養(yǎng)中hanks液、d-hanks液和消化液的配制方法"="" border="1" height="400" data-cke-saved-src="http://sky.scnu.edu.cn/life/class/cellbiologylab/experim/lexp/2%E2%80%943%E2%80%945.gif" src="http://sky.scnu.edu.cn/life/class/cellbiologylab/experim/lexp/2%E2%80%943%E2%80%945.gif" width="599" style="vertical-align: middle; border: 0px;">
(二)配制Hanks液
1.按表2—3—5稱取Hanks試劑。
2.配制Hanks時，需將CaCl2另溶解于100 mL的蒸餾水中。
3.依次加入上述試劑至700 mL蒸溜水中，溶解后再與CaCl2溶液一起定容至1 000 mL。
4.10磅，10 min高壓滅菌。
(三)配制胰蛋白酶消化液
1.D.Hanks液高壓滅菌之后，晾至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?br />2.稱取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中(夏天時研磨器應放在冰浴中)，加入少量D-Hanks液研磨1 000次左右，調制成糊狀。再放入4℃預冷的適量D-Hanks液中，4℃下磁力攪拌使*溶解。
3.用NaHC03干粉將胰酶溶液的pH值調至8.0左右(胰酶作用的zui適pH值)，并加入0.02%EDTA以協(xié)助消化作用。
4.濾過除菌(方法見二、培養(yǎng)基的配制)，-20℃凍存。
注意事項：
1.BSS的pH值應確定為7.2左右。
2.如配制的Hanks液高壓滅菌后液體變混，則可將100 mL的CaCl2與含有其他成分的液體分別裝瓶高壓滅菌之后，再在無菌條件下配制，定容。這樣可以避免高壓滅菌后液體變混。
3.胰酶受熱易失活，所以盡量避免盛夏配制，并且在配制過程中溫度應始終保持在4℃左右。
4.胰酶研磨要充分，否則在過濾時會將較大的顆粒過濾掉，不能達到真正的濃度。
5.胰酶分裝時盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因為冷凍保存時體積會膨脹，而多次使用同一瓶胰酶反復凍融會降低消化效果并可能造成污染。
D-hanks液和hanks液間區(qū)別是hanks液中含有MgCl2 、MgSO4 、CaCl2和葡萄糖，而D-hanks中不含有這些，D-hanks液主要用于消化液等，Ca/Mg離子可以降低消化液中胰蛋白酶的活性，嚴重影響消化的效果。所以只有D-hanks液用于消化液。